Casově rozlišená fluorescenční mikroskopie: principy, techniky a aplikace v nervové soustavě

Fluorescenční mikroskop je optický nástroj, který umožňuje vizualizovat struktury v buňkách a tkáních díky použití fluorochromů, jejichž fluorescence je vyvolána exitačním světlem. V prostředí laboratoří se k tomuto účelu využívají různé typy mikroskopů od klasického světlého pole až po vysoce sofistikované konfokální systémy s bezfiltrovými děliči a flexibilní detekcí.

Základní princip fluorescenční mikroskopie a relevanci pro nervovou soustavu

Princip fluorescenční mikroskopie je založen na zobrazení molekul v minimálním množství díky záření (fluorescenci) fluorochromu po dopadu ultrafialového světla. Nejčastěji se využívá vazby fluorochromu na molekulu proteinu či specifickou sekvenci nukleových kyselin. Fluorochrom v excitačním světle září a emitované světlo je odděleno od excitačního světla filtrem, který propustí pouze emitované světlo charakteristické pro daný fluorochrom. Tento princip umožňuje sledovat lokalizaci a interakce proteinů v nervové soustavě, například v cytoskeletu neuronálních buněk a v synaptických strukturách.

U pokročilejších systémů bývá vzorek osvětlen bílým laserem nebo výkonnými lasery v užívaných vlnových délkách 405 nm až 670 nm, přičemž volba čar a jejich kombinace je řízena tak, aby odpovídala konkrétním fluorochromům. Rozšíření obsahuje bezfiltrový dělič svazku AOBS (Acousto-Optical Beam Splitter), který umožňuje kombinaci až osmi excitačních čar současně, což je zvláště užitečné při zkoumání více fluorochromů současně, například při studiu interakcí proteinů v nervové buňce nebo při analýze distribučních vzorů specifických proteinů v různých částech nervového systému.

Konfokální mikroskopie a živé zobrazení neuronálních struktur

Hlavní moderní mikroskop pro záznam v našem popisu je konfokální mikroskop vybavený bílým laditelným laserem umožňujícím výběr libovolné excitační čáry nebo kombinace až osmi čar současně z viditelného spektra 470-670 nm. Kromě bílého laseru je k dispozici i klasická jedno a více čarová optika z blízké UV oblasti (405 nm) až po dělení v celé viditelné oblasti pomocí Ar, DPSS a HeNe laserů. Tím je umožněna přesná vizualizace různých fluorochromů v neuronech, glie a synapsích, včetně sledování dynamických procesů v živých vzorcích.

Detekční část systému zahrnuje kombinaci spektrálně laditelných detektorů - PMT (fotomultiplikátory) a hybridiní detektory HyD (GaAsP). Tyto detektory poskytují vysokou citlivost a nízký šum, což je klíčové pro zobrazení slabě emitovaného světla z fluorochromů v tenkých vrstvách nervové tkáně či v mikroglii a dalších buňkách nervového systému.

Využití fluorescenční mikroskopie v biologii nervové soustavy

Fluorescenční mikroskopie má široké uplatnění v neuronálních a glionálních strukturách: identifikace složek cytoskeletu v eukaryotních buňkách, lokalizace buněčných organel a sledování biochemických dějů. Ve studiích nervové soustavy se fluorochromy často používají k vizualizaci aktivity proteinů transportovaných po axonech, synaptických vesikul a mitochondrií, stejně jako k identifikaci specifických nukleových sekvencí v buňkách neuronů. Díky živému zobrazení lze sledovat pohyb proteinů a interakce mezi transportními proteiny, které hrají klíčovou roli v neuritové výstavbě a plasticitě synapsí.

Ve vakovitých oblastech (vemikrobiologii i cytogenetice) se fluorescenční mikroskopie používá pro identifikaci buněk a vzorků s ohledem na specifické markery, což umožňuje analyzovat distribuci molekul v nervovém tkání a vyšetřovat interakce mezi strukturami na molekulární úrovni. Při obarvení dvou různých proteinů fluorochromy různých barev lze studovat jejich vzájemnou interakci, například transport mezi transportními systémy neuronálního cytoskeletu či vztah proteinů při signálních drahách.

Praktické aspekty a tipy pro práci s nervovou soustavou

Na praktických pracovištích jsou mikroskopy přístupné proškoleným uživatelům z řad zaměstnanců. K světlému poli i fluorescenci lze tedy využívat vzpřímený motorizovaný mikroskop s celou sadou suchých i imerzních objektivů a s digitální citlivou kamerou pro záznam obrazu. Pro záznam interakcí a dynamických procesů je klíčová vysoká citlivost detekce a schopnost kombinovat více fluorochromů současně bez rušivého excitačního světla. U nervové soustavy je důležité volit fluorochromy s vhodnými excitačními a emisními spektry, zvažovat fototoxicitu při živém pozorování a používat vhodné filtry a bariérové elementy pro minimalizaci vzniku pozadí a ztrát signálu.

V praxi lze využít zejména kombinaci fluorochromů na proteinech a nukleových kyselinách pro záznam lokalizace a dynamiky v nervových buňkách. Fluorescenční mikroskopy nacházejí široké uplatnění ve vědeckém výzkumu, zdravotnictví, biologii i farmaceutickém průmyslu, a slouží jako klíčový nástroj pro vizualizaci struktur a procesů v nervové soustavě.

Příklady použití a ukázky

• Vizualizace cytoskeletu neuronů a jeho změn během synaptické plasticity.
• Detekce a sledování transportních proteinů po axonech za použití více fluorochromů.
• Identifikace buněčných organel v neuronech a glia, včetně mitochondrií a endosomů.

Motivující ukázkou mohou být videa a animace demonstrující interakce proteinů během pohybu virových částic v infikované buňce, nebo zobrazení vrstvení buněk při lokalizaci proteinů v buňce. Podobně mohou být použita videa k zobrazení průběhu zobrazení různých vrstev buňky a lokalizace fluoroforů ve vzorcích nervové tkáně.

Calcium imaging of neurons in live animals

Fluorescenční mikroskopy nacházejí široké uplatnění ve vědeckém výzkumu, zdravotnictví, biologii, chemii i farmaceutickém průmyslu. Na Mikroskop-shop.cz nabízíme kvalitní fluorescenční mikroskopy, které splňují náročné požadavky profesionálního prostředí. Zvětšení: 40-1000x. S fotoaparátem. V rámci vzdělávání lze využívat i demonstrační záznamy a animace, které ilustrují principy fluorescence, interakce proteinů a vizualizaci nukleových kyselin.

Významná je schopnost kombinovat více fluorochromů a analyzovat jejich vzájemné vztahy v rámci nervové soustavy, což usnadňuje pochopení komplexních biochemických drah a struktur v neuronálních okruzích.

Fluorescence lifetime imaging is an optical method which is used for imaging and analysis of molecular processes in biological environment. One of the possible uses is detection of uorescent particles, determination of properties in surrounding uorophore or observation of nanoparticles' interaction with other materials. In the first part of this bachelor's work, there is described a theory regarding principles of uorescence and nanoparticles. There are also comparison of time resolved and standard confocal methods, optimalizations of procedures of sample preparation and experiments in the second part. The results of optimalization procedures are mainly a suitable solution concentration and its adjustment with cationic polymer. The main result is a method, which allows to detect binding of polymer to nanoparticles. Fluorescenční mikroskop je optický mikroskop využívající fluorescenci k zobrazení organických i anorganických struktur. Ve fluorescenční mikroskopii se využívá kratších vlnových délek v oblasti UV záření, kdy látka absorbuje ultrafialové paprsky a emituje viditelné světlo delších vlnových délek, které je pak pozorovatelné světelným mikroskopem.

Dochází k ozáření atomu, kde za normálních okolností obíhají elektrony kolem jádra ve vrstvách (orbitalech) s určitou energetickou hladinou. Při UV záření elektrony absorbují energii a jsou vybuzeny (excitovány) do vyšší energetické hladiny. Elektrony jsou na vyšší energetické hladině nestabilní a vracejí se zpět do základního stavu. Zdrojem záření většinou bývá vysokotlaká rtuťová výbojka. Křemenná trubice v sobě ukrývá malé množství rtuti a inertního plynu. V intervalu 356-546 nm vydá největší množství energie. Výkon výbojek bývá různý, používají se výbojky s výkonem 50, 100 a 200 W. Excitační záření projde nejdříve excitačním filtrem. Tento filtr dovolí prostupu světla jen o výše zmíněné vlnové délce. Zabraňuje prostupu světla o vlnových délkách záření emitovaného (fluorescenčního), to by vyvolalo nežádoucí barevné pozadí. Záření se odráží a prochází přes objektiv na vyšetřovaný vzorek. Ve vzorku vyvolají excitaci elektronů a následné vyzáření světla.

Emitované záření má větší vlnovou délku a šíří se všemi směry. Díky imerznímu objektivu a oleji prochází jen část z něj a dále dopadá rovněž na dichroické zrcadlo. Toto zrcadlo odstraňuje nežádoucí excitační záření o vysoké intenzitě (nebezpečné pro oko, zhodnocení pozorování) a propouští emitované záření. Emitované záření dále prochází bariérovým filtrem. Ten propouští jenom emitované záření v délce podle používaného fluorochromu, kratší vlnové délky zastaví.

Používá se taktéž v laboratořích, ale má jiné uspořádání. Zdroj záření je umístěn stejně jako u klasického mikroskopu pod preparátem. Zvláštně uspořádaný zástinný kondenzor pak propustí světlo tak, aby na vzorek dopadalo z boku. Nebezpečné excitační světlo pak letí mimo objektiv a objektivem prochází jen světlo emitované. Tento typ fluorescence se vyskytuje pouze v některých buňkách (především v rostlinných buňkách, pletivech) a intenzita fluorescence nebývá příliš silná. Tento typ spočívá v nanesení fluorescenční látky (fluorochromu) na zkoumané struktury, která nám je po ozáření umožní zobrazit.

Mezi známé fluorochromy pro vizualizaci nukleových kyselin patří např. akridinová oranž, ethidium bromid nebo DAPI (4´, 6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid). Dále FITC (fluorescein-5-isothiokyanát), TRIC, Texas Red. Mezi velmi používané markery řadíme i zelený fluorescenční protein GFP (green fluorescent protein), který byl izolován z mořské řasy Aequorea victoria a díky němu můžeme sledovat označené struktury v buňce. Fluorescenční mikroskopie nám jak první umožnila vizualizovat struktury cytoskeletu eukaryontních buněk, využívá se v imunohistologii, imunocytologii a imunocytochemii. V buněčné biologii je hojně využíván k identifikaci složek cytoskeletu, buněčných organel nebo ke sledování biochemických dějů. V mikrobiologii se využívá fluorescenční mikroskop k identifikaci různých bakteriálních rodů. V cytogenetice se využívá metoda FISH (in situ hybridizace), kdy pomocí fluorescenčně značené DNA (RNA) sondy detekujeme určité vybrané úseky DNA či chromozomů a můžeme diagnostikovat např. Buňka.

tags: #casove #rozlisena #fluorescencni #mikroskopie