Elektronová mikroskopie: historie, principy a klíčoví průkopníci

První komerčně využitelný transmisní elektronový mikroskop byl vyroben v roce 1939 firmou Siemens. Tento typ mikroskopu je svou konstrukcí a principem činnosti bližší světelnému mikroskopu, který zobrazuje pro světlo průsvitný vzorek. Základní princip činnosti TEM, který je schematicky zobrazen na obr. Základem je zdroj elektronů, který produkuje tzv. primární elektrony. Ty jsou ještě před opuštěním zdroje elektronů zformovány do svazku, v němž jsou elektrony s přibližně stejnou kinetickou energií. Svazek elektronů je urychlován pomocí anody, která současně formuje i trajektorii elektronů. Zásadním rozdílem vzhledem k SEM je umístění a vlastnosti vzorku. Elektrony se vzorkem interagují a procházejí do dalších částí elektronového mikroskopu. Pomocí projekčních čoček jsou formovány tak, aby většina elektronů dopadla do detektoru. Obr. Elektrony, které reagují se vzorkem různými způsoby, jsou detekovány odlišně. A proto mohou vytvořit různé typy obrazů téhož vzorku.

První možností interakce je průchod elektronů vzorkem (viz obr. 211). Takto prošlé elektrony nepředávají vzorku svou energii; tu předají až detektorům, ve kterých jsou detekovány. Tento typ elektronů se podílí na obrazu označovaném jako BF (Back Focal). Obr. Druhou možností je absorpce primárního elektronu (viz obr. 212). V tomto případě předává primární elektron svou kinetickou energii jinému elektronu v elektronovém obalu atomu vzorku. Další osud tohoto elektronu je závislý na energetickém stavu, ve kterém se atom nachází. Obr. Třetí možností interakce elektronu s materiálem vzorku je nepružný rozptyl elektronu v elektrostatickém poli ostatních elektronů (viz obr. 213) nebo pružný rozptyl v elektrostatickém poli atomového jádra. Závisí totiž na vzájemné hmotnosti interagujících objektů. Tento typ interakce se podílí na vzniku DF (Dark Fieldd) obrazu; na něm jsou světlé plochy odpovídající místům vzorku, která rozptylují elektrony. Současně má tento typ interakce vliv i na ED (Electron Diffraction) obraz, který je dán difrakcí elektronů. Obr. Čtvrtou možností interakce primárních elektronů s elektrony v atomovém obalu atomů vzorku je vznik charakteristického rentgenového záření. Primární elektron vyrazí jiný elektron na nižší energetickou hladinu (nebo z atomu ven) a na jeho místo přejde elektron z vyšší energetické hladiny. Při tomto přechodu vyzáří kvantum rentgenového záření (viz obr. 214). Tento typ interakce se podílí na EDX (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy) obrazu, pomocí kterého lze získat informace o prvcích přítomných ve vzorku. Obr. V případě TEM lze navíc proměřit i difrakci elektronů, která v SEM nenastává. Příčina je jednoduchá: SEM pracuje ve skenovacím režimu a na vzorek tedy dopadá úzký svazek primárních elektronů postupně do různých míst vzorku (vzorek je svazkem elektronů skenován). V TEM dopadají elektrony na výrazně větší plochu povrchu vzorku, a proto mohou po průchodu vzorkem vytvořit difrakční obrazec. Schematicky je tato situace zobrazena na obr. 215 a obr. 216.

Obr. Obr. Zkoumat objekty mnohem menší než buňky či bakterie, dokonce až na úrovni jednotlivých atomů? To není žádná vědecká fantazie, ale každodenní realita výzkumných laboratoří po celém světě. U nás položil základy pro rozvoj této fascinující metody fyzik Armin Delong, který by se letos 29. ledna dožil 100 let. Elektronová mikroskopie funguje na úplně jiném principu než klasické mikroskopy, které známe třeba ze školy. Ty využívají k zobrazování objektů světlo, ale kvůli jeho omezené vlnové délce nemohou zobrazit příliš malé objekty. Elektrony mají mnohem kratší vlnovou délku, a proto dokážou zachytit i detaily, které by v klasickém mikroskopu zůstaly neviditelné. Jako kdybyste místo běžného dalekohledu dostali supercitlivý přístroj, který vám umožní vidět jednotlivá zrnka prachu na povrchu Měsíce.

Princip elektronového mikroskopu je překvapivě jednoduchý. Elektrony jsou v přístroji urychleny na velmi vysokou rychlost a následně zacíleny na zkoumaný vzorek - a buď se od něj odrážejí, nebo se na něm rozptylují, anebo způsobují uvolňování dalších elektronů, popřípadě vznik rentgenového záření. Všechny tyto reakce přístroj zaznamenává a analyzuje a výsledkem je neuvěřitelně detailní obraz, který vědcům umožňuje pochopit strukturu zkoumaného vzorku. Existují dva hlavní typy elektronových mikroskopů: transmisní (TEM) a rastrovací neboli skenovací (SEM). Transmisní nechává elektrony procházet vzorkem a tím umožňuje dívat se do jeho vnitřní struktury. Rastrovací mikroskop sleduje elektrony, které se od vzorku odrážejí, a vytváří tak trojrozměrný obraz jeho povrchu. Oba typy mají své výhody a dohromady tvoří silný nástroj, který v rukou vědců odhaluje i ta nejmenší tajemství přírody.

Elektronová mikroskopie nachází uplatnění jak v základním, tak aplikovaném vědeckém výzkumu. Umožňuje například analýzu široce uplatňovaných nanomateriálů nebo polovodičů, které používáme v počítačích, telefonech či solárních panelech. V medicínském výzkumu se pomocí elektronových mikroskopů studují například struktury virů, což je zásadní pro vývoj vakcín. A dal by se uvést bezpočet dalších příkladů toho, k čemu lze využívat zobrazování pomocí elektronů namísto světla. Dá se říct, že bez této možnosti bychom o mnoha věcech stále věděli jen velmi málo.

Obrázek 2: Využití transmisního elektronového mikroskopu pro odhalování skrytých defektů uvnitř nanočástic. Ačkoli to vypadá jednoduše, skutečný provoz elektronového mikroskopu není jednoduchý. Příprava vzorku musí být bezchybná, aby nedošlo k jeho deformaci a poškození, a provádí se ve speciálních podmínkách, protože celý zobrazovací proces pak probíhá ve vakuu. S tím jsou spojeny vysoké odborné nároky na obsluhu a zároveň značné finanční náklady - nehledě na pořizovací cenu samotného mikroskopu. To všechno dohromady podstatně limituje dostupnost elektronové mikroskopie.

Za vývojem této technologie stála řada vědců a techniků, mezi něž patřil i český fyzik s francouzskými kořeny Armin Delong. Právě on ve čtyřicátých letech minulého století položil základy pro rozvoj elektronové mikroskopie v tehdejším Československu, dá se bez nadsázky říct, že svými inovacemi pomohl československé vědě stát se součástí světové špičky. Brno, kde pracoval, je dnes rodištěm některých z vůbec nejpokročilejších elektronových mikroskopů na světě a přibližně třetiny všech, které se vyrobí. Delongův odkaz je tedy stále živý a chtěli jsme jej v tomto článku připomenout u příležitosti letošních 100 let od fyzikova narození. Až příště zavítáte do iQLANDIE, možná už tu bude místo dosavadní makety elektronového mikroskopu zbrusu nový funkční přístroj. Uvidíte pak nejen to, jak vypadá, ale i co všechno dokáže. Možná právě tady objevíte svět, který je očím neviditelný, ale přesto nesmírně důležitý.

Věda totiž umí otevřít okna i do těch nejmenších koutů reality, kam se běžně nepodíváme. O autorovi OH Ondřej Havelka, vědec a pedagog Technické univerzity v Liberci (TUL), katedra chemie. Další články autora popisují, že Elektronový mikroskop je často uváděn jako příklad typického vynálezu 20. století. K jeho sestrojení nestačila jedna geniální myšlenka, ale cesta k němu vedla přes postupné skládání objevů mnoha badatelů ve spojení s technologickým pokrokem. Jedním ze základních kamenů této mozaiky byl objev elektronu, který popsal J.J. Thompson v roce 1897. Objevení elektronu bylo v přímé souvislosti se studiem elektrických výbojů v Geisslerově trubici, známé už v polovině 19. století.

Dalším krokem vedoucím k použití elektronů k zobrazení mikrosvěta byl poznatek, který v roce 1925 publikoval Luis de Broglie, že rychle letící částice mají nejen korpuskulární, ale i vlnový charakter jako např. viditelné světlo. Toto potvrdili nezávisle na sobě v roce 1927 Davisson s Germerem a Thompson s Reidem elektronovou difrakcí, která jasně demonstrovala vlnovou povahu elektronů. Důležitou roli na cestě k elektronovému mikroskopu sehrály práce H. Buscha, uveřejněné v roce 1926, které se zabývaly analogií ve vychylování paprsku elektronů pomocí magnetických polí solenoidů a světla skleněnou čočkou. Konkrétní představa o možnosti zkonstruovat transmisní elektronový mikroskop vznikla pravděpodobně o dva roky později na Vysoké škole technické v Berlíně v kolektivu vedeném Knollem a Ruskou. První mikroskop (obr. 1) zkonstruoval tento tým na začátku třicátých let a v roce 1932 se v článku Knolla a Rusky objevily první fotografie z elektronového mikroskopu a popis konstrukce elektromagnetické čočky. Úspěšnou komerční výrobu transmisních elektronových mikroskopů zahájila v roce 1939 firma Siemens a Halske (obr. 2), která u svých přístrojů zaručovala rozlišovací schopnost 10 nm. Cesta skenovacího elektronového mikroskopu na svět byla o něco složitější a pomalejší. V roce 1938 německý fyzik M.von Ardenne popsal teoreticky i prakticky princip rastrování u transmisního elektronového mikroskopu. Vlastní skanovací elektronový mikroskop poprvé sestrojil americký vědec Zworikyn, který vynalezl fotonásobič a použil je k detekci sekundárních elektronů. Konstrukcí SEMu se v Anglii ve stejné době zabývala skupina vědců vedená C.W.Oatleyem a výsledky jejich práce byly použity k výrobě komerční verze firmou Cambridge Scientific Instruments v roce 1965 (obr. Vývoj a technologický pokrok dosažený od dob konstrukce prvních mikroskopů dokumentuje 3 MV transmisní elektronový mikroskop (obr. 4), který představuje nejvýkonnější nástroj pro pohled do mikrosvěta, který zatím člověk vytvořil. Tyto mikroskopy byly postaveny dva, jeden v Japonsku a jeden ve USA na konci osmdesátých let minulého století a díky nim lidé poprvé spatřili atom.

V bývalém Československu v šedesátých letech vznikla v Ústavu přístrojové techniky v Brně velmi silná skupina vedená V. Drahošem a A. Delongem, která se zabývala konstrukcí elektronových mikroskopů. Výsledkem jejich činnosti byla úspěšná řada elektronových mikroskopů Tesla BS (obr. 5). V současné době se pro privatizaci Tesly v Brně vyrábí mikroskopy pro holandskou firmu Philips a ve firmách Delong Instruments a Tescan (obr. 6) se kromě SEM vyrábí nejrůznější příslušenství k elektronovým mikroskopům. Samostatnou historickou kapitolu představuje využití elektronových mikroskopů v biologii. Již od počátku vývoje TEM bylo zřejmé, že preparáty připravené k pozorování budou muset být velmi tenké vzhledem k malé penetrační schopnosti elektronového paprsku a navíc zbavené vody z důvodu vysokého vakua v tubusu mikroskopu. Prvními biologickými objekty pozorovanými mikroskopem byly vlákna bavlny, krevní buňky, různé druhy baktérií, ale i chitinové schránky hmyzu, rozsivky nebo rostlinný materiál. Většina preparátů byla zpracována ve formě suspenze, nakápnuté na síťku s nosnou blankou. V mikroskopu bylo tedy možné pozorovat jen jejich povrchové kontury, nikoli vnitřní strukturu. Bylo zřejmé, že pro nový typ mikroskopu bude třeba nalézt i vhodné metody přípravy preparátu. Na základě zkušeností ze světelnou mikroskopií se nejprve k přípravě ultratenkých řezů používaly vysokoobrátkové ultramikrotomy, kde z nehybného vzorku ukrajoval tenké řezy nůž otáčející se obrovskou rychlostí - přístroj z roku 1946 dosahoval až 49000 obrátek za minutu. Problém byl ale se sběrem řezů, které se rozptylovaly ve vzduchu ve směru tangenty k dráze nože. Přelom přišel v konci padesátých let, kdy se zcela změnila konstrukce přístroje. Na pohyblivé rameno ultramikrotomu byl pevně připevněn preparát a proti němu byl postaven pevný nůž s vaničkou naplněnou vodou tak, aby dosahovala k řezné hraně. Po přiblížení nože a vzorku ukrojené ultratenké řezy sklouzávaly z řezné hrany na hladinu, kde již bylo možné celkem pohodlně s nimi manipulovat a nabírat je na síťky. Další mnohaleté úsilí pak bylo věnováno nalezení vhodných fixačních a zalévacích postupů, které by umožnily zobrazit ultrastrukturu jednotlivých biologických objektů co nejblíže jejich nativnímu stavu. Optický mikroskop byl v biologii po staletí základním výzkumným nástrojem. Posunutí meze rozlišení téměř na atomární úroveň, které do biologického výzkumu přinesla elektronová mikroskopie, otevřelo obrovské možnosti. Transmisní elektronový mikroskop umožnil uvidět viry, nejmenší živé organismy. Na konci 17. století Antoine van Leeuwenhoek z Holandska vytvořil jednoduchý mikroskop s jednou čočkou. Tento nový vynález s konstrukcí podobnou moderní lupě se odlišoval tím, že jeho zvětšení dosáhlo více než 200násobku. Přibližně ve stejné době vytvořil Robert Hooke z Anglie složený mikroskop, který měl dvě čočky, čočku objektivu a okuláru. Hooke pozoroval korkovou tkáň a nazval ji buňkami, protože vypadala jako malé buňky plástve. Tak vytvořil biologický termín: buňka. Tehdy spojení dvou čoček nepříznivě ovlivnilo přesnost, částečně kvůli aberaci čoček, což mělo za následek nižší rozlišení než u jednoduchého mikroskopu. V 19. století se rozlišení mikroskopu dramaticky zlepšilo prostřednictvím různých opatření. Korekce aberace byla provedena použitím lepších čoček nebo kombinací čoček a byla podporována německými společnostmi jako Zeiss a Leitz, které byly hlavními přispěvateli. Navzdory těmto významným zlepšením v mikroskopii objevil výzkumník George Airy v 19. století limit rozlišení založený na povaze světla. Rentgenové záření a elektron byly objeveny postupně na konci 19. století a na konci dvacátých let 20. století byla představena teorie elektronové čočky. Vývoj mikroskopů s vyšším rozlišením na počátku 20. století je výsledkem použití těchto paprsků s krátkou vlnovou délkou jako zdroje světla. Transmisní elektronový mikroskop (TEM) vynalezl Ernst Ruska z Německa na počátku třicátých let 20. století a první komerční TEM vyvinula společnost Siemens v roce 1939. Vývoj skenovacího elektronového mikroskopu (SEM) začal přibližně ve stejné době jako vývoj TEM. Další v pořadí byl skenovací transmisní elektronový mikroskop (STEM), který vyvinul Manfred Ardenne na konci třicátých let 20. století, následovaný vývojem prototypu moderního SEM od Vladimira Zworykina na počátku čtyřicátých let 20. století. Zworykinův SEM však měl nízké rozlišení, takže vývoj SEM pokračoval prostřednictvím projektů v laboratoři Charlese Oatleyho na University of Cambridge v padesátých letech 20. století. Kromě zlepšení rozlišení se na elektronových mikroskopech stále provádí mnoho vylepšení. Jedním z nich je vývoj environmentálního skenovacího elektronového mikroskopu, který udržuje komoru pro vzorky v nízkém vakuu pro pozorování vzorků obsahujících vlhkost. Pokud máme v nějakém průmyslovém odvětví zastoupení na celém světě, je to elektronová mikroskopie.

První elektronový mikroskop sestrojil v polovině 20. století Armin Delong, jehož práce položila základy pro československý rozvoj elektronové mikroskopie. Jeho otcem zakladatele elektronové mikroskopie byl Očadlík; Delong byl významnou autoritou a byl lídrem, který se dívá dopředu. Na Delongově rodném Brně a jeho práci navazovali studenti, kteří dále rozvíjeli tuto technologii v Česku. Delongova výzkumná činnost pokračovala ve firmách Delong Instruments a Tescan, a jeho kancelář na Ústavu přístrojové techniky Akademie věd nese jeho jméno. Za svou práci obdržel řadu ocenění, včetně zlaté medaile EXPO 1958 v Bruselu za prototyp elektronového mikroskopu BS242.

Na přelomu století byla elektronová mikroskopie klíčovým nástrojem pro studium biologických vzorků: ultratenké řezy, preparáty bez vody a techniky preparace umožnily vizualizaci virů, buněk a ultrastructury. Vznik TEM a SEM otevřel procedury pro studium nanostruktur a materiálů v nejmenších měřítkách a urychlil pokrok v biologii, materiálové vědě a technologiích.

tags: #elektronova #mikroskopie #historie