V medicíně je světelná mikroskopie jednoznačně nejčastější metodou zobrazování a studia mikrostruktury zkoumaných objektů; především tkání a buněčných kultur, ale i neživých objektů, např. implantátů. Rozlišovací schopnost světelné mikroskopie, tj. schopnost rozlišit a zobrazit nejmenší objekty, je však omezena vlnovou délkou viditelného světla - fotonů. Běžná světelná mikroskopie tak neumožňuje odlišit dva body bližší než cca 250 μm. V posledních letech se však podařilo zvýšit rozlišovací schopnost optické mikroskopie pomocí metod superrozlišovací mikroskopie, která v nejlepších případech dokáže odlišit dva body bližší než cca 60 nm. Avšak na pozorování buněčné ultrastruktury, ultrastruktury materiálů (např. lomové plochy prasklých implantátů) atp. je to stále málo. Právě proto se využívají i jiné zobrazovací metody, a to především elektronová mikroskopie.
Elektronový mikroskop je obdoba světelného mikroskopu, ve kterém jsou fotony nahrazeny elektrony a skleněné čočky elektromagnetickými čočkami. Elektromagnetická čočka je v podstatě cívka, která vytváří vhodně tvarované magnetické pole. Transmisní elektronový mikroskop zobrazuje ultrastruktury vzorku pomocí svazku prošlých elektronů. Náš transmisní elektronový mikroskop JEOL JEM-1400+, který byl do projektu vložen jako věcný příspěvek, pracuje s urychlovacími napětími 40 - 120 kV. Je tak vhodný především pro pozorování biologických vzorků (typicky při urychlovacích napětích 80 - 120 kV), ultrastruktury nanomateriálů (kvantové tečky, nano grafen, nano partikule TiO2 atp.) a tenkých materiálových vzorků, jejichž tloušťka je maximálně desítky nm. Ke generování elektronového svazku využívá mikroskop katodu LaB6, která v porovnání s klasickou wolframovou katodou dosahuje vyšší intenzity svazku a rovnoměrnějšího ozáření vzorku. Maximální garantované rozlišení mikroskopu je 0,38 nm v případě bodového obrazu a 0,2 nm u mřížkového obrazu. Mikroskop umožňuje pozorování klasických vzorků na standardních mřížkách Ø 3 mm. Je také vybaven držákem a speciální evakuační stanicí pro uchovávání a pozorování kryogenicky zmražených vzorků.
Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS, EDX, EDXS nebo XEDS); někdy také nazývána energy dispersive X-ray analysis (EDXA nebo EDAX) nebo energy dispersive X-ray microanalysis (EDXMA); je analytická metoda pro prvkovou nebo chemickou analýzu vzorků, která zjišťuje složení zkoumaného vzorku, a to pomocí analýzy charakteristického záření, které vzniká interakcí vzorku s dopadajícími elektrony. Pro pozorování v transmisním elektronovém mikroskopu je potřeba připravit velmi tenké vzorky o tloušťce kolem 100 nm, aby je elektrony byly schopné prozářit a vytvořit dostatečně jasný obraz. K tomu se používá zařízení na krájení vzorků, tzv. ultra mikrotom. V našich laboratořích jsme schopni připravit a pomocí transmisního elektronového mikroskopu JEOL JEM-1400+ pozorovat nejen klasické ultratenké řezy se standardní fixací, kontrastováním a řezy pro imuno-detekci, ale také speciální vzorky zpracované velmi šetrnou metodou - kryogenickým zmrazením pro zachování maxima buněčné ultrastruktury a pro speciální imuno-detekční techniky. Přípravu takových vzorků provádíme pomocí kryo ultra mikrotomu PowerTome PCZ firmy RMC Boeckeler s kryostanicí pro krájení hluboce zmrazených vzorků. PowerTome PCZ je schopen automatického krájení vzorků o volitelné tloušťce (0 nm - 15 nm) rychlostmi 0,1 - 100 mm/s. Díky tomu lze krájet vzorky speciálně připravené v pryskyřicích nebo zmrazené, a to za pomocí skleněných nebo diamantových nožů.
Skenovací (či také rastrovací nebo řádkovací) elektronový mikroskop je další zobrazovací zařízení pro pozorování ultrastruktury povrchů zkoumaných vzorků. Pro zobrazování se používá úzký svazek elektronů, který postupně skenuje povrch materiálu a z každého místa provádí analýzu signálů pomocí sady detektorů. Náš skenovací elektronový mikroskop JSM-IT500HR/LA firmy JEOL je vybaven detektory sekundárních elektronů (SED), detektory zpětně odražených elektronů (BED) pro vysoké i nízké vakuum a EDS detektorem s SDD čipem, aktivní plochou 30 mm2 a rozlišením 129 eV s detekcí prvků od Be po Pu. Mikroskop umožňuje pozorování vzorků ve vysokém i v nízkém (min. do 150 Pa) vakuu. Dosahuje rozlišení ≤1,5 nm při urychlovacím napětí 15 kV ve vysokém vakuu (řádově 10-6 - 10-7 Pa) a ≤ 1,8 nm při urychlovacím napětí 15 kV při nízkém vakuu (do 150 Pa).
Autor textu: doc. RNDr. Brno - Bakterie, houby, prvoci - všichni patří mezi mikroorganismy, které lidské oko nevidí, pokud se tedy nepoužije mikroskop. Ještě lepší rozlišení nejen těchto organismů, ale například i virů, proteinů nebo organel, útvarů uvnitř buněk, poskytují elektronové mikroskopy. Tento týden v Brně probíhají Dny elektronové mikroskopie (DEM). Tato akce se koná od roku 2017 každé jaro a od roku 2023 ji primárně zastřešuje Hvězdárna a planetárium Brno. Spolupracují na ní také Masarykova univerzita, Vysoké učení technické nebo Vida! science centrum. Cílem je seznámit návštěvníky s elektronovými mikroskopy a jejich významem pro vědu, a to pomocí přednášek, diskusí, workshopů nebo výstav. Letošním tématem jsou bakteriofágy, mikroskopické viry bojující s bakteriemi. Dny elektronové mikroskopie nabízejí program pro širokou veřejnost. Workshopy, přednášky a výstavy probíhají po celý týden, hlavním dnem programu je však sobota 29. března. Návštěvníci budou mít možnost nahlédnout do laboratoří CEITEC a přímo navštívit firmy, které vyrábějí elektronové mikroskopy. První elektronový mikroskop vynalezl a zkonstruoval Ernst Ruska v roce 1931, o padesát pět let později za něj získal Nobelovu cenu. „Elektronový mikroskop se od klasického světelného liší v tom, že namísto světla se projektuje elektrony," popisuje fungování mikroskopu aplikační vědec Erik Zachar. „Zároveň máme dva typy elektronových mikroskopů, vyšší rozlišení nám poskytuje transmisní mikroskop. Ten nám zobrazí hluboké struktury materiálu. Druhý typ se nazývá skenovací, ten ukazuje jen povrch materiálu, ale zato ve 3D formě. Jeho výhoda je, že je více user-friendly a jeho cena je o něco nižší," řiká dál Zachar.
„Brno je možné považovat za takovou Mekku elektronové mikroskopie,“ tvrdí mluvčí Ústavu přístrojové techniky Pavla Schieblová, která se na programu podílí také. V jeho laboratořích si zájemci mohou vyzkoušet používání elektronových mikroskopů. Podívají se, jak pod mikroskopem vypadá pyl, plíseň nebo jak vypadají jejich vlastní vlasy. V Brně sídlí tři velké firmy vyrábějící elektronové mikroskopy: Thermo Fisher Scientific, Tescan a Delong Instruments. Jejich přístroje používají například na americké univerzitě Harvard nebo v NASA. „My s nimi pracujeme v rámci základního výzkumu - a často hrají klíčovou roli při objevení dosud neviděného. Nejčastěji je využíváme ve strukturní biologii, kde naši vědci studují procesy na úrovni jednotlivých buněk, molekul a atomů,“ popisuje mluvčí vědeckého centra CEITEC MUNI Halina Jílková. „Právě díky elektronové mikroskopii například popsali taktiku enterovirů, které dokážou využít přirozených buněčných procesů k infekci,” vysvětluje dál. Zájem i důležitost oboru reflektuje i to, že Masarykova univerzita otevřela loni nový magisterský obor Mikroskopie. Cílem studia je získat profesní kvalifikaci odborníka v oblasti mikroskopických metod pro aplikační i výzkumnou práci.
Pod pojmem mikroskop si lidé nejčastěji představují optický přístroj využívající viditelného světla pro pozorování velmi malých objektů. Elektronové mikroskopy jsou také optické přístroje, které však místo světelného svazku používají elektrickým polem urychlené elektrony a místo skleněných čoček jsou použity čočky elektromagnetické. Aby nedocházelo k interakcím elektronů s atmosférou, která ovlivňuje dráhu letících elektronů, musí být pozorovaný vzorek i svazek elektronů umístěn ve vakuu. Jednou z hlavních charakteristik mikroskopů je mezní rozlišovací schopnost, jež je úměrná vlnové délce použitého záření. Elektronové záření s podstatně kratší vlnovou délkou (~0,01-0,001 nm), než má viditelné světlo (400-700 nm), umožňuje dosáhnout mnohem vyššího rozlišení.
Obr.1 Typická velikost objektů, které lze pozorovat elektronovým mikroskopem. Bez nadsázky lze říci, že elektronové mikroskopy patří mezi nejvšestrannější přístroje pro pohled do mikrosvěta, a to nejen v oblasti materiálového výzkumu. Mohou poskytnout komplexní informaci o mikrostruktuře, krystalografii, chemickém složení, ale i o dalších vlastnostech zkoumaného vzorku. Záleží na tom, jakou informaci pocházející z interakce elektronového svazku se zkoumaným vzorkem využijeme. Chceme-li zjistit např. chemické složení zkoumané látky, musí mít mikroskop nainstalován detektor charakteristického rentgenového záření.
Obr.2 Při dopadu elektronů na vzorek dochází k vzájemné interakci a vzniká množství různých signálů, které nesou informaci o pozorovaném vzorku. Elektronové mikroskopy se dají zjednodušeně rozdělit do dvou kategorií, pro které se vžilo označení řádkovací elektronové mikroskopy neboli SEM (scanning electron microscope) a transmisní elektronové mikroskopy označované zkratkou TEM (transmission electron microscope). Schéma jejich optické soustavy je uvedeno na obrázku 3. Řádkovací elektronové mikroskopy se využívají pro zobrazení a analýzu povrchů téměř libovolně velkých vzorků (je-li dostatečně velká vakuová komora pro jejich umístění). Transmisní elektronové mikroskopy nacházejí využití při pozorování a analýze vnitřní struktury vzorku a pro zobrazení jednotlivých atomů. Nutnou podmínkou pro použití TEM je, že vzorek musí být dostatečně tenký (10-500 nm) aby jím svazek elektronů prošel.
První pokusy s transmisním elektronovým mikroskopem (TEM), ale i jeho úspěšnou realizaci uskutečnil v roce 1931 německý vědec Ernest Ruska. Pomocí TEM lze studovat vznik, vlastnosti a vzájemné působení jednotlivých poruch krystalové struktury vzorků. Na obrázku 6 je zobrazena mikrostruktura hliníkové slitiny Al-3%Mg-0,2%Sc v nejbížnějším módu TEM, tzv. světlém poli. V mikrostruktuře lze rozpoznat jednotlivé krystaly, které se nazývají „zrna“. Slitina s touto mikrostrukturou byla připravena v Oddělení kovů FZÚ tzv. intenzivní plastickou deformací s následným žíháním při teplotě 400 °C po dobu jedné hodiny.
Další technikou je tzv. vysokorozlišovací transmisní elektronová mikroskopie (High Resolution TEM neboli HRTEM). Jedná se o zobrazení jednotlivých atomů uspořádaných v krystalové mřížce materiálu. Ve vysokorozlišovací elektronové mikroskopii je nutno zvolit takovou orientaci vzorku vůči primárnímu svazku elektronů, aby zobrazované sloupce atomů měly směr rovnoběžný s primárním svazkem. Na stínítku mikroskopu pak vidíme jejich projekci. Nutnost volby této orientace omezuje možnosti pozorování. Světlé body na obrázku 8 tedy odpovídají atomovým sloupcům. Obr. 8. Atomární zobrazení polykrystalického křemíku pomocí HRTEM.
První použitelný řádkovací elektronový mikroskop (SEM) byl zkonstruován V.K. Zworykinem a kol. v roce 1942, první komerčně dostupný SEM pak spatřil světlo světa v roce 1965. Typický řádkovací elektronový mikroskop je vidět na obrázku 9. SEM umožňuje pozorování a charakterizaci vzorků, jejichž rozměry jsou omezeny pouze velikostí vakuové komory, do níž se vzorek vkládá. Za jakýsi vyšší stupeň SEM lze považovat tzv. dvousvazkový mikroskop. Jedná se o zařízení, které v sobě kombinuje dva svazky - elektronový a fokusovaný iontový svazek. Někdy bývají tyto přístroje označovány jako SEM-FIB.
Obr.10. Na obrázku 11 je vidět diamantová vrstva připravená technologií MWPECVD v Oddělení funkčních materiálů FZÚ. Deponovaná vrstva vyniká výjimečnou biokompatibilitou, tepelnou vodivostí, pružností a otěruvzdorností, které se uplatňují např. při povlakování medicínských implantátů. Obr.11. Obrázek 12 ukazuje vzorek materiálu, který byl připraven v Oddělení magnetizmu FZÚ. Jedná se o nanopóry s průměrem přibližně 30 nm ve struktuře oxidu hlinitého (Al2O3). Nanopóry vznikly v důsledku samouspořádavacího efektu během anodizace. Cílem projektu je vyvinout materiál pro paměťová média (např. harddisky).
Ve spodní části obrázku jsou uvedeny parametry nastavení mikroskopu, při kterých byl vzorek pozorován. Zleva jsou postupně uvedeny datum a čas pozorování, urychlovací napětí svazku (HV), proud svazku (curr), vzdálenost mezi vzorkem a finální čočkou elektronového tubusu (WD), použitý detektor na snímání signálu (det) a měřítko. Obr.12. Na obrázku 13 jsou vidět částice zlata na uhlíkové podložce. Obr. 13. Na obrázku 14 je zobrazena zlomená tuha do mikrotužky. Obr.14. Poslední snímek (obrázek 15) znázorňuje nečistotu velikosti přibližně 0,003 mm (pro srovnání tloušťka lidského vlasu je ~0,05 mm) na vyleštěném monokrystalu hořčíku. Obr.15.
Cílem této prezentace bylo jednouchou formou seznámit zájemce s problematikou elektronové mikroskopie a jejím využitím při výzkumu. Uvědomujeme si, že výčet zde prezentovaných technik není ani zdaleka kompletní a v některých pasážích jsme se dopustili i určitých nepřesností a zjednodušení. Vše v zájmu srozumitelnosti čtenáři. Pokud Vás problematika elektronové mikroskopie zaujala a chtěli byste se s ní blíže seznámit např. Předložená dizertační práce s názvem “Rastrovací elektronová mikroskopie a její aplikace pro senzitivní vzorky” pojednává o problematice rastrovací elektronové mikroskopie v kontextu instrumentálního a metodologického vývoje vedoucí k inovativnímu řešení, které je dobře aplikovatelné zejména v mikrobiologickém výzkumu.
Mezi zkoumanými mikrobiologickými kmeny byly biofilm-pozitivní bakterie Staphylococcus epidermidis a kvasinky jako Candida albicans a Candida parapsilosis, jež jsou považovány za klinicky významné, protože se podílejí na vzniku závažných infekcí zejména u imunokompromitovaných pacientů. Dále byl studován vliv růstu biofilmu bakterie Bacillus subtilis na biodeteriorizaci a biodegradaci poly--kaprolaktonových fólií. Vývoj v oblasti cryo-SEM byl aplikován ve výzkumu mikrobů s biotechnologickým potenciálem, jako jsou např. Cupriavidus necator a Sporobolomyces shibatanus.
The presented dissertation thesis titled “Scanning electron microscopy and its applications for sensitive samples” describes an instrumental and methodological development in the field of scanning electron microscopy leading to an innovative solution that could be particularly applicable in microbiological research. A summary of the history and current state of electron microscopy (EM) as a scientific imaging and analytical technique is provided in the introductory chapters. The undeniable contribution of EM in the biological and medical sciences is evidenced by many cited scientific publications. This dissertation thesis contains innovations and improvements in specimen preparation and cryogenic scanning electron microscopy (cryo-SEM) produced at the Institute of Scientific Instruments of the CAS in Brno. In particular, the new constructions of special sample holders together with methodological development in the field of microbiological sample preparation resulted in finding optimal parameters for individual processes. In the experimental part there is showed a verification of methodological procedures in the study of hydrated and electron beam sensitive specimens. Subsequent comparison of different methodological approaches on a defined microbiological system contributes to extending the interpretation of the hitherto known results. Among the microbiological strains investigated were the biofilm positive bacteria Staphylococcus epidermidis and yeasts such as Candida albicans and Candida parapsilosis, which are considered to be clinically significant because they are often involved in serious infections and especially threaten immunocompromised patients. Furthermore, the effect of the biofilm formation of Bacillus subtilis on the biodeterioration and biodegradation of poly--caprolactone films was studied. Rastrovací (skenovací) elektronová mikroskopie (SEM) se používá pro mimořádně přesnou analýzu mikrostruktury součástí s vynikající hloubkou ostrosti a vyšším rozlišením. Tato metoda vytváří obrazové snímky povrchu vzorku s velmi velkým zvětšením. Rychlá 3D analýza poruch. Průřezová analýza materiálu v pouhých čtyřech krocích. ZEISS ZEN core je váš software pro propojenou mikroskopii a analýzu obrazu. Tento software vám zobrazí kompletní přehled: Poskytuje jedno uživatelské rozhraní pro výsledky všech mikroskopů. Používáme ZEISS ZEN Intellesis pro automatickou segmentaci a lepší analýzu složek druhé fáze u dvoufázové oceli. Automatická kontrola velkých a malých dílů? Pomocí elektronové mikroskopie dokážeme poměrně rychle diagnostikovat přítomnost virů a bakterií v klinickém materiálu. Vzhledem k velikosti virů v řádu nanometrů je elektronová mikroskopie jediným způsobem zobrazení virových částic. Nespornou výhodou této neselektivní metody je možnost diagnostiky všech agens přítomných ve vzorku na rozdíl od jiných alternativních a mnohdy vysoce specifických metod přímého průkazu. Tím je tato metoda unikátní, neboť s jejím využitím lze detekovat a zobrazit jakékoliv viry přítomné ve vyšetřovaném vzorku včetně těch, jejichž přítomnost nebyla předpokládána nebo které nejsou dosud známy. Elektronovou mikroskopií lze rovněž identifikovat neznámé viry, které byly vykultivovány na tkáňových kulturách. Elektronový mikroskop poskytuje návaznost a komplexnost mikrobiologické diagnostiky. Je důležitou doplňkovou metodu k ostatním metodám přímé diagnostiky. TEM je jedinou metodou přímého průkazu agens, která v případě pozitivního výsledku poskytuje spolehlivě pravdivý důkaz o existenci virů v klinickém materiálu. Nezastupitelný význam má nejen v diagnostice virů, ale i spirochet a to především rodu Borrelia, které často nalézáme v mozkomíšném moku u pacientů s projevy meningitidy či meningoencefalitidy.
V Brně se koná také aktivita DEM - Dny elektronové mikroskopie, která má za cíl představit lidem význam EM pro vědu prostřednictvím přednášek, workshopů a výstav a umožnit veřejnosti nahlédnout do laboratoří, kde se elektronové mikroskopy vyrábějí a používají.
Elektronová mikroskopie tak nabízí detailní pohled na ultrastrukturu Candida albicans a dalších kandid, které mohou být součástí infekčních procesů u imunokompromitovaných pacientů. Candida albicans a Candida parapsilosis patří mezi významné klinické kmeny, jejichž pozorování v EM může poskytnout cenné informace o jejich biologii a interakcích s hostitelem. Zároveň lze studovat vliv biofilmu na biodeterioraci a biodegradaci materiálů používaných v medicíně, například u biokompatibilních povrchů implantátů.
TL;DR: Elektronová mikroskopie, včetně TEM a SEM, umožňuje obrazově a analyticky detailně pozorovat ultrastruktury buněk, virů a materiálů na nano- až atomární úrovni, a představuje klíčový nástroj v biomedicínském výzkumu i diagnostice.
tags: #elektronovy #mikroskop #candida