V medicíně je světelná mikroskopie jednoznačně nejčastější metodou zobrazování a studia mikrostruktury zkoumaných objektů; především tkání a buněčných kultur, ale i neživých objektů, např. implantátů. Rozlišovací schopnost světelné mikroskopie, tj. schopnost rozlišit a zobrazit nejmenší objekty, je však omezena vlnovou délkou viditelného světla - fotonů. Běžná světelná mikroskopie tak neumožňuje odlišit dva body bližší než cca 250 μm. V posledních letech se však podařilo zvýšit rozlišovací schopnost optické mikroskopie pomocí metod superrozlišovací mikroskopie, která v nejlepších případech dokáže odlišit dva body bližší než cca 60 nm. Avšak na pozorování buněčné ultrastruktury, ultrastruktury materiálů (např. lomové plochy prasklých implantátů) atp. je to stále málo. Právě proto se využívají i jiné zobrazovací metody, a to především elektronová mikroskopie. Elektronový mikroskop je obdoba světelného mikroskopu, ve kterém jsou fotony nahrazeny elektrony a skleněné čočky elektromagnetickými čočkami. Elektromagnetická čočka je v podstatě cívka, která vytváří vhodně tvarované magnetické pole. Transmisní elektronový mikroskop zobrazuje ultrastruktury vzorku pomocí svazku prošlých elektronů. Náš transmisní elektronový mikroskop JEOL JEM-1400+, který byl do projektu vložen jako věcný příspěvek, pracuje s urychlovacími napětími 40 - 120 kV. Je tak vhodný především pro pozorování biologických vzorků (typicky při urychlovacích napětích 80 - 120 kV), ultrastruktury nanomateriálů (kvantové tečky, nano grafen, nano partikule TiO2 atp.) a tenkých materiálových vzorků, jejichž tloušťka je maximálně desítky nm. Ke generování elektronového svazku využívá mikroskop katodu LaB6, která v porovnání s klasickou wolframovou katodou dosahuje vyšší intenzity svazku a rovnoměrnějšího ozáření vzorku. Maximální garantované rozlišení mikroskopu je 0,38 nm v případě bodového obrazu a 0,2 nm u mřížkového obrazu. Mikroskop umožňuje pozorování klasických vzorků na standardních mřížkách Ø 3 mm. Je také vybaven držákem a speciální evakuační stanicí pro uchovávání a pozorování kryogenicky zmrazených vzorků. Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS, EDX, EDXS nebo XEDS); někdy také nazývána energy dispersive X-ray analysis (EDXA nebo EDAX) nebo energy dispersive X-ray microanalysis (EDXMA); je analytická metoda pro prvkovou nebo chemickou analýzu vzorků, která zjišťuje složení zkoumaného vzorku, a to pomocí analýzy charakteristického záření, které vzniká interakcí vzorku s dopadajícími elektrony. Pro pozorování v transmisním elektronovém mikroskopu je potřeba připravit velmi tenké vzorky o tloušťce kolem 100 nm, aby je elektrony byly schopné prozářit a vytvořit dostatečně jasný obraz. K tomu se používá zařízení na krájení vzorků, tzv. ultra mikrotom. V našich laboratořích jsme schopni připravit a pomocí transmisního elektronového mikroskopu JEOL JEM-1400+ pozorovat nejen klasické ultratenké řezy se standardní fixací, kontrastováním a řezy pro imuno-detekci, ale také speciální vzorky zpracované velmi šetrnou metodou - kryogenickým zmrazením pro zachování maxima buněčné ultrastruktury a pro speciální imuno-detekční techniky. Přípravu takových vzorků provádíme pomocí kryo ultra mikrotomu PowerTome PCZ firmy RMC Boeckeler s kryostanicí pro krájení hluboce zmrazených vzorků. PowerTome PCZ je schopen automatického krájení vzorků o volitelné tloušťce (0 nm - 15 nm) rychlostmi 0,1 - 100 mm/s. Díky tomu lze krájet vzorky speciálně připravené v pryskyřicích nebo zmrazené, a to za pomocí skleněných nebo diamantových nožů. Skenovací (či také rastrovací nebo řádkovací) elektronový mikroskop je další zobrazovací zařízení pro pozorování ultrastruktury povrchů zkoumaných vzorků. Pro zobrazování se používá úzký svazek elektronů, který postupně skenuje povrch materiálu a z každého místa provádí analýzu signálů pomocí sady detektorů. Náš skenovací elektronový mikroskop JSM-IT500HR/LA firmy JEOL je vybaven detektory sekundárních elektronů (SED), detektory zpětně odražených elektronů (BED) pro vysoké i nízké vakuum a EDS detektorem s SDD čipem, aktivní plochou 30 mm2 a rozlišením 129 eV s detekcí prvků od Be po Pu. Mikroskop umožňuje pozorování vzorků ve vysokém i v nízkém (min. do 150 Pa) vakuu. Dosahuje rozlišení ≤1,5 nm při urychlovacím napětí 15 kV ve vysokém vakuu (řádově 10-6 - 10-7 Pa) a ≤ 1,8 nm při urychlovacím napětí 15 kV při nízkém vakuu (do 150 Pa). Autor textu: doc. RNDr.
Jak elektronový mikroskop doplňuje světelnou mikroskopii při studiu Candida
Elektronový mikroskop zobrazuje ultrastruktury vzorku pomocí svazku prošlých elektronů a umožňuje detailní pohled na buněčné povrchy a intracelulární struktury, které světelná mikroskopie nedokáže rozlišit.
Pro biologické vzorky, jako jsou Candida, je vhodné využít kryogenické přípravy vzorků, která maximalizuje zachování ultrastruktury a umožňuje následnou imuno-detekci.
Kombinace JEOL JEM-1400+ a skenovacího mikroskopu JSM-IT500HR/LA poskytuje širokou škálu analýz: od vysokého rozlišení v transmisním režimu po povrchové a chemické analýce prostřednictvím EDS.
Praktické možnosti a vzorkování
Pro pozorování je potřeba připravit tenké vzorky o tloušťce kolem 100 nm, což umožní průchod elektronů a vznik jasného obrazu.
PowerTome PCZ umožňuje automatické krájení vzorků s volitelnou tloušťkou a je navržen pro práci se vzorky z pryskyřic i zmrazenými vzorky.
EDS/EDX detekce umožňuje chemickou analýzu složení vzorku na mikroskopické úrovni, což je užitečné při identifikaci prvků v buňkách a materiálech souvisejících s Candida.
Srovnání s tradičním světelným mikroskopem ukazuje, že elektronový mikroskop dosahuje výrazně vyššího rozlišení a umožňuje detailní studium ultrastruktur, které je zásadní pro pochopení interakcí buněk s implantáty a materiály.
Technické parametry a možnosti našich mikroskopů
- Transmisní JEOL JEM-1400+ pracuje s urychlovacími napětími 40-120 kV, typicky 80-120 kV pro biologické vzorky.
- Maximální garantované rozlišení 0,38 nm bodový obraz a 0,2 nm mřížkový obraz.
- LaB6 katoda pro vyšší intenzitu svazku a rovnoměrné ozáření.
- Možnost pozorování na standardních mřížkách Ø 3 mm a kryogenní zmrazení vzorků.
- EDS/EDX detektor pro chemickou analýzu prvků.
- Skenovací elektronový mikroskop JSM-IT500HR/LA s detektory SED, BED a EDS (SDD 30 mm2, 129 eV).
- Rozlišení ≤1,5 nm při 15 kV ve vysokém vakuu a ≤1,8 nm při nízkém vakuu.
Autor textu: doc. RNDr.
tags: #elektronovy #mikroskop #candida