Fluorescence je jev, kdy molekula po excitaci elektromagnetickým zářením o vhodné vlnové délce při návratu do základního stavu vyzáří energii ve formě fotonu. Je možné měřit i slabý fluorescenční signál na pozadí intenzivního excitačního záření. Fluorescenční spektroskopie využívá závislosti emisních vlastností fluoroforu na prostředí, přenosu elektronové exitační energie mezi donorem a fluoreskujícím akceptorem a polarizované fluorescence.
Spektroskopie se zabývá vznikem a vlastnostmi spekter; je to metoda založená na vzájemném působení elektromagnetického záření a zkoumané látky, při kterém dochází k výměně energie. Zkoumaná látka může záření pohlcovat nebo vyzařovat, a spektroskopie pak měří emise a absorpci různých vlnových délek viditelného i neviditelného záření. Samotné spektrum je závislost intenzity elektromagnetického záření prošlého vzorkem. Spektroskopii lze rozdělit podle několika měřítek: Ramanova, IR, UV-VIS a další. První spektroskop sestrojili Kirchhoff a Bunsen (1860).
Spektroskop je přístroj určený pro rozkládání viditelného světla na jednotlivé složky a pozorování spekter; je založený na rozkladu světla hranolem či mřížkou. Molekula v základním stavu může absorbovat elektromagnetické záření, čímž dojde k excitaci elektronu. Pro naše účely jsou důležité deaktivační procesy, při nichž dochází k vyzáření světelného kvanta. Fluorescence je vyvolána buď účinkem jiného dopadajícího záření, nebo účinkem dopadajících částic. Emisní záření trvá krátkou dobu a po zhasnutí excitačního záření téměř okamžitě také ona zhasíná.
Emisní spektrum vyjadřuje závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní excitační vlnové délce a zobrazuje vnitřní fluorofory a jejich prostředí. Vnitřní fluorescence buněk bývá podmíněna přítomností některých proteinů obsahujících aromatický cyklus; aminokyseliny tryptofan, tyrosin a fenylalanin vykazují fluorescenci v UV oblasti. V UV oblasti dále vykazují fluorescenci mitochondrie a jadérka. Pro identifikaci vitaminu A ve tkáních se využívá jeho intenzivní fluorescence ve 480 nm. Vnitřní fluorescence proteinů lze využít při stanovování koncentrace látky, avšak při použití vnějších fluoroforů je citlivější díky poloze molekuly proteinu.
Nevlastní neboli vnější fluorofory jsou látky široce využívané ve spektroskopii. Fluorescenční sondy a fluorescenční značky se dělí podle typu vazby na studovanou látku: kovalentní vazba u značek a nekovalentní u sond. Fluorescenční značky zahrnují např. fluoresceinizothiokyanát a tetrametylrhodaminizothiokyanát; sonda bývá zavzata nekovalentně. Rozlišujeme také dynamické zhášení fluorescence, které může být využito při stanovení změn koncentrace iontů Cl−, a excimeru při vysoké hustotě značení. Zhášení může být nežádoucí, ale zároveň užitečné v některých měření nacházejících se v rámci fluorescenční spektroskopie.
Spektroskopie umožňuje bezkontaktně a nedestruktivně získávat kvantitativní i kvalitativní informace o látce podle intenzity a vlnových délek spektrálních čar. Fluorescenční spektrální analýza vychází z toho, že každá látka emituje určité vlnové délky jinak; fluorescenční spektroskopie je díky své citlivosti perspektivní v řadě oborů. Spektrofluorimetrická detekce se často používá v zapojení k průtokovému systému, například při sekvenční injekční analýze; fluorescenční sondy a značky nacházejí široké uplatnění.
Dále fluorogenní indikátory umožňují stanovení koncentrace analytu v neznámém vzorku. Příkladem je indikátor Fura-2, který vykazuje spektrální posuv v přítomnosti Ca2+. Fluorescenční spektroskopie se užívá také pro studium životnosti buněk: esterázami aktivované fluoreskující produkty umožňují měřit membránovou integritu a nitrobuněčnou retenci produktů. Detekce mrtvých buněk se provádí barvivy pro nukleové kyseliny, která jsou méně pronikající do živých buněk.
Imunoanalytické metody využívají fluorescenční detekci, kde enzym‑analogii nahradí fluorescenční sondy. Imunoanalytické metody se dělí na heterogenní a homogenní, podle nutnosti separace vázaného imunokomplexu. Dále se dělí na kompetitivní a nekompetitivní s protilátkou/antigenem. Kvantifikace látky může být realizována měřením koncentrace označeného imunokomplexu či volného označeného antigenu; obě cesty vedou k nelineární závislosti.
Historicky patří mezi první metody radioimunoanalýzy (RIA) s radioaktivními značkami, následovaly enzymoimunoanalýzy (EIA) s enzymy jako alkalická fosfatáza nebo peroxidáza; ELISA je jednou z nejznámějších heterogenních enzymových imunoanalýz. Pokročilejší homogenní metody zahrnují EMIT, a polární fluorescenční imunoanalýzy (FPIA) s fluoresceinem. Luminiscenční imunologické metody (LIA) zahrnují chemiluminiscenci a elektrochemiluminiscenci; CMIA a ECLIA jsou běžnými variantami. V praxi se často používají metody nefelometrie či turbidimetrie pro detekci imunokomplexů.
Imunoanalytické metody se široce používají pro rutinní stanovení koncentrace léčiv, zejména díky automatizaci, rychlosti analýzy a vysoké průchodnosti vzorků. Sady reagencií a automaty jsou nabízeny pro monitorování léků jako antiepileptika, digoxin, teofylin a další, často s tabulkovými přehledy o využívaných metodách pro jednotlivé látky. V plazmě mohou výsledky být až o 30 % nižší než v séru; dlouhodobě skladovat lze při -70 °C, avšak některé látky je lepší uchovávat v mrazícím prostředí a některé to může rušit. Konjugáty a ferry se používají ve specifických typech imunoanalytických postupů, včetně radiálních separací a biotin-streptavidin mostů.
V souvislosti s fluorescenčními značkami a sondami se často používají komplementární imunoanalytické postupy, které umožňují měření na základě emise světla dané koncentrace. Rozmanité aplikace zahrnují detekci troponinu I v séru či plazmě, kde se využívá buď radiální separace, nebo luminescencí na konkrétních substrátech. Detekční rozsahy, cutoff hodnoty a citlivosti jsou uvedeny v tabulkách různých studií a metod, které popisují rozsah měření, linearitu a přesnost jednotlivých postupů.
V konečném souhrnu lze říci, že fluorescenční imunoanalýza kombinuje vysokou citlivost fluorescenční detekce s flexibilitou imunoanalytických platforem, a díky tomu nachází široké uplatnění v klinické diagnostice, toxikologii a farmakologii, včetně terapeutického monitorování léků a analýz biologických vzorků.
Klíčové pojmy a rozdělení metod
- Fluorescense a emise fotonů po excitaci
- Vnitřní vs. vnější fluorofory
- Polarizace fluorescence a její využití
- Žhávící a excimerové efekty ve vysoké hustotě značení
- Heterogenní vs. homogenní imunoanalýzy
- Kompetitivní a nekompetitivní azapojení
- CMIA, ECLIA, ELISA a EMIT jako významné techniky
- Tableární přehled použití v terapeutickém monitorování
Přehled typů detekce a jejich principů
Spektrofluorimetrická detekce často pracuje s markerem, který je navázán na imunoreakci a detekován fotonickou emisi; v případě EIA a ELISA se používají substráty umožňující měření změn v absorbanci nebo luminescenci. Elastické parametry jako cutoff hodnoty, mez detekce a linearita jsou klíčové pro validaci každé metody. V případě radiálních metod je nutné zvláštní zacházení s radioaktivními izotopy, zatímco v moderních chemiluminiscenčních metodách se používají luciferiny a další chemické substráty pro světélkování.
Praktické aplikace a příklady použití
V imunoanalytice se používají fluorescenční sondy a značky pro identifikaci a kvantifikaci analýtů v séru či plazmě, včetně výpočtů koncentrací antigenů a protilátek. Příkladem je indikátor Fura-2 pro Ca2+ a fluorescenční markery pro detekci nukleových kyselin. Fluorescenční metody jsou užitečné pro měření životnosti buněk a pro detekci apoptózy pomocí svalových nebo nukleových markerů. Imunoanalytické metody se díky automatizaci staly standardem v monitorování léčiv a v toxikologických analýzách.
Speciální poznámky k praktickým metodám: signály z fluorescenčních značek mohou být ovlivněny environmentálními faktory, jako je hustota značení, polarizace světla a excitační- emisionní spektra. V tabulkách uváděných v praxi bývá uveden rozsah měření a citlivost jednotlivých testů pro konkrétní látky, například antiarytmika či antibiotika, s různými detekčními platformami.
Datové tabulky a konkrétní čísla z literatury ukazují širokou škálu detekčních systémů v klinické praxi a jejich vzájemnou komplementaritu. Vybrané metody poskytují kvantitativní výsledky podle intenzity světla emitovaného fluorescence, zatímco jiné metody měří změny v pixelových či spektrálních charakteristikách imunokomplexu. Díky tomu lze vybrat optimální platformu pro daný analyt a vzorek.
tags: #fluorescencni #polarizacni #imunoanalyza