Migrace a dlouhodobá kolonizace kvasinkové bakterie Lactobacillus fluorescens mikroskop

Abstract a hlavní poznatky: Benefiční účinky probiotického kmene Lactiplantibacillus plantarum (dříve Lactobacillus plantarum) vycházejí z jeho schopnosti přilnout se a kolonizovat střevní trakt, avšak průběh migrace a dlouhodobá kolonizace zůstávají málo prozkoumané. Tato práce hodnotí způsoby kolonizace vGIT u RS-09 a identifikuje kmen s potenciálem dlouhodobé střevní přítomnosti. Zavedli jsme CFDA/SE značení RS-09 k studiu časového a prostorového rozložení v intestinálním traktu a k analýze jeho přetrvávání v různých částech střeva pomocí toku cytometrie (flow cytometry).

Ve studii bylo prokázáno, že RS-09 uchovává silné adhezní schopnosti i při kyselém (pH 2,5) a zásaditém (pH 8,5) prostředí. CFDA/SE může být rovněž použito jako indikátor značení RS-09 v in vivo, v intestinálním traktu. Byla vytvořena kinetická modelová rovnice růstu RS-09 k objasnění jeho perzistence ve střevním traktu. In vivo perzistence ukázala, že perzistence RS-09 byla nejvyšší v slepém střevě (cecum) 69,5 % a nejnižší v dvanáctníku (duodenum) 12,8 % po 96 hodinách. Po 20 dnech byla RS-09 převážně lokalizována v slepém střevě a v kontu ře pokračovala v koloně. Tyto studie poskytují nové poznatky o dlouhodobé perzistenci L. plantarum v gastrointestinálním traktu. Značkovací systém CFDA/SE může být použit pro studium in vivo kolonizační dynamiky dalších probiotických kmenů.

Úvod

Rod Lactobacillus jsou gram-pozitivní, homofermentativní, termofilní a nekveťující tyčinky. Jedná se o prospěšné mikroorganismy běžně se vyskytující v GI traktě lidí a zvířat. Lactiplantibacillus plantarum, dříve označovaný jako „Lactobacillus plantarum“, je jedním z nejrozšířenějších bakteriálních druhů a je odolný vůči kyselinám; často se nachází v fermentovaných rostlinných potravinách. Má důležité fyziologické funkce; studie ukazují, že L. plantarum dominuje v intestinálním traktu a vykazuje silnou antibakteriální aktivitu vůči patogenním mikroorganismům a odolnost vůči různým stresům, včetně podmínek gastrointestinálního traktu. Pro bezpečnost L. plantarum a její prospěšné efekty na zdraví lidí proběhlo mnoho studií o izolaci a výběru nových kmenů s probiotickými charakteristikami a odolností vůči podmínkám zpracování kultur.

Podle FAO/WHO regulací (2002) musí probiotika vykazovat vysokou toleranci vůči GIT podmínkám a vysokou adhezi pro udržení rovnováhy střevní mikrobioty. Střevní podmínky (pH, žlučové soli, trávicí enzymy) a odolnost vůči kyselinám a žluči mají významný dopad na adhezní schopnost probiotik. Pro zajištění přežití po průchodu GIT je klíčové hodnotit vliv acid-base stresu na tento organismus a jeho adhezní schopnost. Adheze na střevní mukózu je dalším kritériem pro screening probiotik, protože adheze prodlužuje dobu pobytu probiotik v intestinálních dutinách a umožňuje úzký kontakt s intestinálními epitelovými buňkami.

Většina současných metod hodnocení adhese se zaměřuje na HT-29 buněčné linie, které jsou hlavním modelem pro hodnocení adhezní kapacity, a to jak in vitro, tak mimo Čínu. Avšak perzistence bakterií bývá ohrožována jinými kmeny v mikrobiotě, takže je důležité zkoumat dynamiku distribuce a perzistence laktobacilů v různých segmentech GIT. V posledních letech se flow cytometry (FCM) široce používá pro real-time monitorování a kvantitativní analýzu jednotlivých buněk díky vysoké rychlosti, přesnosti a spolehlivosti. Tato technika poskytuje základ pro studium, zda probiotika mohou adherovat a kolonizovat hostitele.

Metody a materiály

RS-09 je Lactic acid bacterium izolovaný z fermentovaného jablka a skladován v CGMCC pod číslem 17118. Zrání a identifikace kmene byly provedeny pomocí automatického identifikačního systému a následného sekvenování 16S rDNA. HT-29 buňky byly kultivovány v DMEM s FBS a doplňky a používány pro adhezní testy. K testům odolnosti vůči kyselinám byl RS-09 kultivován v MRS médiu a inkubován při různých hodnotách pH s následným počítáním kolonií na MRS desky. Testy odolnosti vůči žlučovým solím byly provedeny v médiu s různými koncentracemi žlučových solí a následně hodnoty přežití počítány. Pro SEM analýzu byly buňky upraveny, fixovány glutaraldehydem, dehydratovány a pozlaceny pro vizualizaci.

CFDA/SE značení L. plantarum RS-09 probíhalo v MRS médiu, poté se buňky iniciálně inkubovaly s CFDA/SE a po mytí se přerušily v MRS médiu. Následně byly buňky kultivovány a analyzovány pomocí fluorescenční mikroskopie a FCM pro stanovení pozitivního poměru značených buněk. Adhesion assay zahrnoval in vitro adhezi RS-09 na HT-29 buňky a výpočet adhezní míry porovnáním početnosti buněk před a po adhezi.

Intestinální distribuce RS-09 u myší byla sledována in vivo. 180 samců C57BL/6 bylo rozděleno do dvou experimentů (90/90). RS-09 byl značen CFDA/SE a podán 500 μL na myš, zatímco kontrola dostala 500 μL PBS. V různých časových bodech byly odebrány obsahy různých částí střeva a provedena toksicita FD/FC analýza k určení míry CFDA/SE-labeled L. plantarum. Prostatní analýza probíhala logistickou regresí a model polohy bakterií se vyjadřoval Fourierovými řadami.

Flow cytometrie byla provedena na FACS Calibur. Data byla analyzována pro persistenci RS-09 v různých segmentech GIT a pro vztah mezi CFDA/SE signálem a bakteriálním počtem.

Výsledky

RS-09 si zachovává vysokou adhezní kapacitu i při pH 2,5 i 8,5, což ilustruje odolnost vůči acidobazickým stresům. CFDA/SE značení umožnilo sledovat in vivo distribuci RS-09 v traktu a odhalit dynamiku perzistence. Perzistence RS-09 byla nejvyšší v ileu (cecum) během 96 hodin (69,5 %) a nejnižší v duodenu (12,8 %). Po 20 dnech se RS-09 koncentrovala hlavně v ileu a v colon. Modelová analýza ukázala, že perzistence RS-09 v různých částech střeva odpovídá různým Fourierovým řadám: ileum šestá řada, cecum sedmá řada a colon čtvrtá řada. CFDA/SE značení se ukázalo jako spolehlivý nástroj pro in vivo sledování kolonizační dynamiky a lze jej využít u dalších probiotických kmenů.

Adhezní testy na HT-29 buňkách potvrdily význam adheze pro dlouhodobou perzistenci a ukázaly, že in vitro adheze může být doplněna o důkazy z in vivo, čímž se zvyšuje důvěryhodnost výsledků.

Diskuse

Adhezní schopnost a odolnost vůči kyselinám a žluči jsou klíčové pro přežití probiotik v GIT a jejich schopnost kolonizovat střevní trakt. CFDA/SE značení se prokázalo jako vhodný nástroj pro monitorování in vivo distribuce a perzistence. Lze využít při studiu dynamiky kolonizace u dalších probiotických kmenů a doplnit tak in vitro poznatky o praktické in vivo důkazy. Modely Fourierových řad umožňují kvantifikovat perzistenci v různých sekcích střeva a porovnat dynamiku mezi ileem, cecem a colonem.

Vizualizace a doprovodné prvky

V následujícím textu jsou uvedeny návrhy doprovodných vizuálních prvků pro lepší srozumitelnost článku.

Tabulka by mohla obsahovat klíčové hodnoty perzistence RS-09 v různých částech střeva po různých časech a odpovídající modelové parametry Fourierových řad.

Tabulka (přehled výsledků)

Další poznámky: CFDA/SE značení je efektivní pro dlouhodobé sledování a může být použito i pro hodnocení dalších probiotických kmenů.

tags: #lactobacillus #fluorescencni #mikroskop