Metody světelné mikroskopie: osvětlení, techniky a aplikace

Důležitou roli v mikroskopii hraje způsob osvětlení vzorku. Metody osvětlení se všeobecně klasifikují na procházející osvětlení a dopadající osvětlení. Osvětluje zadní stranu vzorku. Tato metoda je vhodná pro biologické pozorování, jako jsou bezbarvé, průhledné buňky, a používá se u obecných biologických mikroskopů. Obecná metoda pozorování vzorků osvětlováním jeho zadní strany, aby byla průhledná. Osvětluje zadní stranu jako u osvětlení ve světlém poli, ale přerušuje přímé světlo, aby obrys vzorku zářil proti tmavému pozadí. Osvětluje přední stranu vzorku. Tato metoda je vhodná při pozorování 3D objektů, jako jsou materiály a jiné průmyslové vzorky, jakož i neprůhledné vzorky.

Shromažďuje světlo na zadní straně čočky objektivu. Jedná se o nejběžněji používanou metodu pro procházející osvětlení a vyznačuje se jasným a méně proměnlivým osvětlením. Shromažďuje světlo na povrchu vzorku. Zdroj světla se může lišit v závislosti na použitém mikroskopu. Světlo zvenčí je posíláno do reflexního zrcadla, aby osvětlilo vzorek. Tato lampa, známá také jako vysokotlaká rtuťová lampa, se používá jako zdroj světla pro pozorování fluorescence k vybuzení vlnové délky specifické pro fluorescenční materiál. Dokáže poskytovat silný výkon v širokém rozsahu vlnových délek, od ultrafialové až po blízkou infračervené, a může přenášet světlo požadované vlnové délky pomocí filtru. Pro různé vlnové délky je k dispozici široká škála filtrů a při použití správné kombinace fluorescenčního barviva lze selektivně detekovat specifickou fluorescence. Protože LED diody vyzařují světlo s relativně úzkým pásmem vlnových délek, lze bílé světlo získat kombinací LED a fluorescenčního materiálu nebo kombinací více LED diod.

Valná většina mikroskopických pozorování je prováděna na klasických optických světelných mikroskopech. Existuje však řada objektů, které v takových mikroskopech pozorovatelné nejsou. V těchto případech je nezbytné, aby mikroskop byl vybaven zvláštním doplňkem pro zkontrastnění struktur objektu. Inverzní - pozorování živých buněčných struktur (ve specifických nádobách). Polarizační - krystalické struktury, minerály. Je mikroskop, v němž je obraz zvětšován dvěmi sadami spojných čoček: objektivem a okulárem. V biologii se pro účely optické mikroskopie užívají objektivy různé síly, tj. různé zvětšovací schopnosti.

Používá se zde ultrafialových paprsků, z elektrických obloukových lamp nebo ze rtuťových výbojků, které vyvolají světélkování předmětu v mikroskopu. Zkonstruoval v roce 1903 H. Siedentopf a R. Zsigmondy. Pro zobrazení ješte menších částic je třeba použít místo světelných paprsků proudu elektronů, které se uvolňují ze žhavých kovů uvedených na záporný potenciál. Proud elektronů prochází elektr.n. magnet. čočkami, tj. elektr. n. magnet. pracuje s proudem elektronů ve vakuu. Rastrovací elektronový mikroskop - pracuje tak, že na vzorek dopadá tenký svazek elektronů, který dopadá postupně na všechna místa vzorku. Odražený (emitovaný) paprsek se převádí na viditelný obraz.

V konfokální mikroskopii se fotony shromažďují fotonásobičkami (PMT) a zpracovávají se za účelem získání ostrého obrazu; mikroskopické čipykamer se skládají z milionů fotodiod. Hlavním složením fotocitlivé diody je fotoelektrický křemík. Mikroskopy se širokým polem jsou buď vzpřímené, ve kterých je sklíčko osvětleno zespodu, nebo inverzní, ve kterých je sklíčko osvětleno shora, jako na obrázku. Inverzní mikroskopy byly vynalezeny pro sledování živých buněk. Obvykle se tyto vzorky pěstují v kapalných roztocích. Obr.5: Vzpřímený mikroskop obsahuje objektiv výše a kondenzátor pod vzorkem. Epi-fluorescence je termín používaný k popisu fluorescenční mikroskopie, ve které se stejná čočka (objektiv) používá k osvětlení i sběru emitovaného světla ze vzorku.

Světlo prochází ze světelného zdroje, prochází sadou filtrů, dichromatickým zrcadlem a objektivem se odráží excitační světlo s kratší vlnovou délkou. Techniky trans-osvětlení zahrnují kontrastní metody, jako je fázový kontrast a diferenciální interferenční kontrastní (DIC) mikroskopie. Avšak transfluorescenční mikroskopie je metoda, která není dobře známa, ani dobře používána. Tato metoda vylučuje použití dichromatických čoček a místo toho excitační světlo prochází kondenzátorem a vzorkem, a poté je emisní světlo shromažďováno objektivem.

Kombinace fluorescenční WF mikroskopie a kontrastních technik může poskytnout cenné informace a obrázky životaschopnosti a morfologie. Konfokální systém má schopnost současně snímat kontrastní i fluorescenční obrazy, které lze překrýt pomocí softwaru pro analýzu obrazu. Ve fluorescenční WF mikroskopii však současné zobrazení vyžaduje použití adaptéru kamery s rozděleným pohledem, nebo použití dvou samostatných kamer. Obvykle bude fluorescenční snímek zachycen kamerou, následuje změna optiky na kontrastní osvětlení, a poté stejná kamera zaznamená kontrastní snímek.

Rozlišení mikroskopu je schopnost rozlišit detaily ve vzorku. Je to minimální vzdálenost, při které lze dva odlišné body vzorku stále považovat za samostatné entity. VeWF mikroskopii je limit rozlišení kolem 200 nm. V konfokálním systému se bodová clona blokuje mimo oblast zaostření; tento systém nabízí ostrý obraz, avšak některé fotony mimo zaostření mohou být ztraceny. Dekonvoluce pomáhá řešit rozmazání po pořízení snímků. FRAP (fotobělení ROS) je technika pro zkoumání mobility molekul v čase a lze ji provádět i veWF.

Mezi pokročilé vysokorozlišovací techniky patří lokalační techniky s jednou molekulou, strukturovaná světelná mikroskopie (SIM), mikroskopie vyčerpání stimulovanou emisí (STED) a GSDIM/dSTORM, které používají lasery a fotopřepínatelné sondy pro zobrazení v čase. Biologický mikroskop využívá k pozorování procházející světlo, avšak pro vzorky je možné využít i jiné režimy osvětlení.

Krystaly a další vzorky často vyžadují specifické techniky; plátky skály a minerály se studují polarizovaným světlem, které se mění v závislosti na vzájemném natočení polarizačních desek a indikují krystalové struktury. Používá se také polarizační mikroskopie pro identifikaci vláken, polymerů, polovodičů a kostních tkání. Mikroskopie s diferenciálním interferenčním kontrastem (DIC) je vhodná pro pozorování bezbarvých vzorků a umožňuje 3D zobrazení; stejně jako fázový kontrast zobrazuje rozdíly v šíření světla, ale jinou optickou cestou. Modulační kontrastní mikroskopie (Relief) převádí výškové rozdíly na jas, lze ji použít s plastovými nosiči a rovněž umožňuje 3D pohled.

Tato technika zvláště využívá odražené světlo k pozorování vzorků, které nepropouštějí světlo, a používá se k identifikaci azbestu a jeho typů prostřednictvím indexového oleje pro optické přizpůsobení. Přehled různých režimů a jejich vlastností je prezentován v tabulce níže.

V závěru článku lze dodat, že kombinace fluorescenční WF mikroskopie a kontrastních technik poskytuje cenné informace o životaschopnosti a morfologii vzorků. Konfokální systém umožňuje simultánní záznam kontrastních i fluorescenčních obrazů, což lze překrýt softwarem pro analýzu obrazu. Ve WF mikroskopii se fluorofory zaznamenávají kamerou a poté se mění optika pro kontrastní osvětlení; u konfokálního systému se používají PMT detektory a optoelektronický záznam obrazu.

V souvislosti s efektivitou osvětlení a rozlišením u WF mikroskopie zmiňme hlavní faktory: limit rozlišení kolem 200 nm, které je ovlivněno i fluorescencí pozadí; konfokální systém s bodovou clonou minimalizuje pozadí, ale některé informace mohou být ztraceny mimo zaostření; dekonvoluce a FRAP pomáhají zlepšit obraz a dynamiku vzorku. LED zdroje dnes poskytují široké spektrum vlnových délek (cca 365-770 nm) a vysokou životnost až 50 000 hodin, což snižuje potřebu údržby a teplotního managementu.

tags: #metody #svetelne #mikroskopie