Profesionální světelný mikroskop (viz obr. 175) obsahuje hranoly, které mění chod světelných paprsků tak, že je směřují do okuláru se dvěma tubusy. V profesionálním mikroskopu se pozorovaný objekt obvykle osvětluje zespodu. Světlo žárovky se koncentruje do svazku paprsků a prochází filtry, kterými projde jen určitá oblast spektra (tj. světlo jen některých vlnových délek), a pomocí hranolu se odráží do kondenzoru. Kondenzor je soustava čoček, které koncentrují světlo na malou oblast vzorku. Světlo procházející vzorkem se pak soustřeďuje jednou z objektivových čoček, které lze otočením celé soustavy čoček měnit podle požadovaného zvětšení.
Pro pozorování neprůsvitných vzorků se používá objektiv, který obsahuje vnější kroužkový kondenzor (viz obr. 176), který je soustřeďuje světlo dolů na vzorek. V uplynulých dvaceti letech zaznamenala optická mikroskopie pozoruhodný rozmach, a to jak v důsledku vysoké kvality nových objektivů navrhovaných počítači, tak díky spojení mikroskopů s vyspělou videotechnikou a následným zpracováním obrazů výkonnými mikropočítači či laserovými zdroji světla. Technický pokrok pozměnil optickou mikroskopii do té míry, že je dokonce patrná jistá renesance jejího užití v buněčné biologii, kde v poválečném období jednoznačně dominovala mikroskopie elektronová.
Optický mikroskop Obyčejný optický mikroskop se skládá z objektivu, který vytváří zvětšený, převrácený obraz zkoumaného předmětu, a okuláru, jímž tento obraz pozorujeme jako lupou (obrázek). Další důležitou částí mikroskopu je zdroj světla s kondenzorem. Zkoumané předměty lze vidět jen díky tomu, že zobrazující záření s nimi nějakým způsobem interaguje. Světlo může být pozorovaným objektem částečně absorbováno, jindy se spíš lomí, odráží nebo rozptyluje, při průchodu objektem se mění fáze světelného vlnění, někdy i jeho polarizace. Některé objekty také mohou emitovat fluorescenci. Skutečnou roli určitého optického jevu, a tím i vzhled obrazu, však nakonec určuje zejména volba mikroskopické techniky.
Pro srovnání s konfokálním mikroskopem není podstatné, jaká je povaha technických rozdílů mezi jednotlivými metodami. Rozlišovací schopnost mikroskopu Pod rozlišovací schopností mikroskopu se chápe minimální vzdálenost dvou bodů objektu, které se ještě zobrazí jako navzájem oddělené. Žádný objektiv nemůže zobrazit bodový objekt opět jako bod. I při dokonalé korekci všech možných vad zobrazení, které souvisí s technologií výroby objektivů, jsou obrazem bodu Airyho kroužky (obrázek). Tak se nazývá difrakční obrazec vznikající ohybem zobrazujícího se světla na čočkách objektivu. Při zobrazení dvou blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se při jisté minimální vzdálenosti stanou téměř nerozlišitelnými. Tato mez se běžně odhaduje dle Rayleighova kritéria (1879), které v podstatě vychází ze skutečnosti, že lidský zrak zaznamená pozvolný předěl mezi dvěma difrakčními kroužky teprve tehdy, poklesne-li intenzita mezi nimi alespoň o 20 % oproti přilehlým maximům. Pro modré světlo (viditelné záření nejkratších vlnových délek) se teoretická rozlišovací schopnost blíží hodnotě kolem 0,17 m.
Pozorování trojrozměrných objektů Skutečné mikroskopické objekty jsou trojrozměrné, čímž se míní, že mají konečnou tloušťku. Teoretické rozlišovací schopnosti mikroskopu lze plně využít jen v případě vzorků o tloušťce menší, než je hloubka ostrosti objektivu, která závisí na jeho numerické apertuře (Zmin = 0,25 nλ/NA2). Při zkoumání silných vzorků, například tkáňových řezů nebo velkých buněk, je kvalita zobrazení, a tím i praktická rozlišovací schopnost mikroskopu, nepříznivě ovlivňována překrýváním obrazu roviny, do níž je mikroskop právě zaostřen, s neostrými obrazy rovin ležících nad ní a pod ní.
Idea konfokálního mikroskopu pochází od Marvina Minského, který si ji patentoval již r. 1957. V té době však zůstala bez odezvy, neboť Minsky nenašel vhodný zdroj světla pro konstrukci funkčního přístroje. O deset let později M. Petráň a M. Hadravský z Lékařské fakulty UK v Plzni patentovali konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče. S tímto přístrojem (v odborné literatuře je znám pod názvem Tandem Scanning Confocal Microscope) byly poprvé získány kvalitní optické řezy silným preparátem, konkrétně mozkovou tkání. Tandemový konfokální mikroskop však nedoznal většího rozšíření v praxi. Éra konfokální mikroskopie začíná až koncem sedmdesátých let, kdy byl zkonstruován první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem. Nikoli náhodou to bylo ve stejné době, kdy se staly běžně dostupnými výkonné minipočítače.
Princip činnosti. Princip laserového rastrovacího konfokálního mikroskopu je znázorněn na obrázku obrázek. Pozorovaný vzorek je osvětlován bodovým zdrojem světla. Tím je laserový paprsek fokusovaný na clonku, která je pak objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu o průměru rovnajícím se rozlišovací schopnosti objektivu (tzv. difrakční mez). Tentýž objektiv pak sbírá světlo vzorkem odražené nebo rozptýlené, popřípadě jeho fluorescenci. Po zpětném průchodu tohoto sekundárního záření objektivem vznikne další obraz bodové clonky, který je pomocí děliče paprsků lokalizován před fotonásobič. Zde se nachází druhá, konfokální bodová clonka, blokující detekci záření pocházejícího z míst vzorku mimo rovinu, do které je mikroskop právě zaostřen. Obraz celé zaostřené roviny pak získáme jejím rastrováním bod po bodu, způsobem, který je v zásadě podobný tomu, jakým svazek elektronů vytváří obraz na televizní obrazovce.
Existují tři základní metody rastrování: cestou rozmítání laserového paprsku nebo příčným posouváním vzorku před objektivem, popřípadě posouváním objektivu nad vzorkem. Při rastrování je měřená intenzita světla registrována počítačem spolu s informací o souřadnicích analyzovaného bodu. Díky prostorové filtraci záření dopadajícího na detektor neobsahuje obraz vytvořený počítačem neostré pozadí pocházející z mimofokálních oblastí vzorku. V tomto smyslu jsou konfokální obrazy vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem. S objektivem o numerické apertuře ~ 1,3 a při použití modrozelené čáry argonového laseru (λ = 488 nm) činí tloušťka optických řezů asi 0,4 m. Prostým vertikálním posouváním vzorku vůči objektivu je navíc umožněno pozorovat optické řezy v různých hloubkách pod povrchem.
Rozdíl mezi obyčejnou a konfokální fluorescenční mikroskopií demonstruje obr. Potlačení mlhavého pozadí obrazu a optická tomografie (zobrazování rovinných řezů vzorkem) nejsou jediným přínosem konfokálního zobrazování. Teoretická rozlišovací schopnost konfokálního mikroskopu se totiž nezakládá na Rayleighově kritériu, jelikož konfokální obraz objektu vzniká postupným skládáním z jednotlivých bodů, které jsou navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry bývají menší než průměr Airyho kroužků. Potíže plynoucí z metody sériového snímání obrazových bodů. Každé měření intenzity světla je zatíženo statistickým šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde N je počet detegovaných fotonů. Je proto zřejmé, že čím slabší je detegované světelné záření, tím horší bude relativní přesnost stanovení intenzity v sousedních bodech, tj. obrazový šum.
Jako nová metoda konfokální mikroskopie existuje současné snímání fluorescenčních obrazů pomocí třech fotonásobičů se spektrálními filtry pro modrou, zelenou a červenou barvu. Další, poměrně nová metoda konfokální mikroskopie spočívá v současném snímání fluorescenčních obrazů pomocí tří fotonásobičů se spektrálními filtry pro modrou, zelenou a červenou barvu.
Konfokální obrazů vznikají v číselné (digitální) formě a lze je dále upravovat všemi běžnými způsoby počítačového zpracování obrazů. Specialitou konfokální mikroskopie je možnost prostorové rekonstrukce mikroskopických objektů, opírající se o několik desítek až stovek optických řezů jedním objektem, postupně snímaných při plynule se měnící hloubce zaostření. Ze souboru optických řezů lze mimo jiné generovat stereoskopické páry - zvětšené obrazy celého trojrozměrného objektu viděné pravým a levým okem. Stereoskopické páry skýtají velmi působivé plastické obrazy preparátů. Ze souboru horizontálních řezů lze také rekonstruovat vertikální optické řezy vzorkem. Vertikální řezy se ovšem dají získat i přímým způsobem, vhodnou volbou rastrovacího algoritmu mikroskopu.
Další, poměrně nová metoda konfokální mikroskopie spočívá v současném snímání fluorescenčních obrazů pomocí třech fotonásobičů se spektrálními filtry pro modrou, zelenou a červenou barvu. Aplikace konfokální mikroskopie. Unikátní schopnosti konfokálního mikroskopu zobrazovat preparáty s trojrozměrným rozlišením se využívá při studiu povrchových vlastností materiálů. V reflexním modu zobrazování se zkoumá textura a složení povrchů i eroze materiálů. Konfokálním mikroskopem se vyhodnocují výsledky mikrotestů tvrdosti kovů i plastických materiálů, měří se výška strukturních elementů na polovodičových čipech. Biologie a lékařský výzkum těží ze skutečnosti, že konfokální mikroskopie je ve své podstatě neinvazivním a nedestruktivním způsobem studia prostorové struktury buněk a tkání. Příkladem, kdy konfokální mikroskopie bezesporu převyšuje možnosti metod klasické mikroskopie, může být studium složité architektury neuronových sítí v mozkové tkáni. Konfokálním mikroskopem lze pomocí speciálních fluorescenčních sond studovat intracelulární koncentrace fyziologicky významných iontů, měřit membránový potenciál nebo vnitrobuněčné pH. Imunofluorescenčními metodami se studuje rozložení receptorů v membránách, organizace cytoskeletu, mitotický aparát během dělení, či struktura endoplazmatického retikula.
Athanasius Kircher, slavný vzdělaný jezuita, spatřil při pohledu přes silně zvětšující čočku růst na listech mechu černé, rohaté chlapy a na řezu stonkem kapradiny dokonce orly. V jeho výzkumech pokračoval zbožný tyrolský farář Scheiner. Přírodu zkoumal vlastnoručně zhotovenými přístroji. Po jeho smrti našli jeho farníci v pozůstalosti podivnou trubičku, v které byla blecha. Bleší skla využívali k pozorování mikrosvěta Nehemiah Grew, Jan Swammerdam a zejména obchodník s látkami, výrobce mikroskopů Antoni van Leeuwenhoek. Jeho přístroje byly nesmírně jednoduché, přesto ve své době neměly konkurenci. Jejich optickou část tvořila jediná čočka zasazená do mosazné destičky, vzorek se umisťoval na hrot před čočku a jeho pozice se dala nastavit dvojicí šroubů. Mikroskop se držel v ruce těsně u oka. Zatímco složitější přístroje ostatních konstruktérů dosahovaly s bídou padesátinásobného zvětšení, Leeuwenhoekovy mikroskopy zvětšovaly až 270krát. Právě to jeho tvůrci umožnilo spatřit do té doby neviděné. Zkoumal snad vše, co bylo možno umístit pod mikroskop - hmyz, krev, zubní povlak, jezerní vodu. Pozoroval bakterie, prvoky, spermie, krvinky, mikroskopické hlísty, vířníky. Historický mikroskop Roberta Hooka. Větší zvětšení poskytl mikroskop složený z objektivu a okuláru vložených v kovové trubici. Mezi vynálezce tohoto zdokonaleného mikroskopu se řadí jména spojená s objevem dalekohledu - optikové Hans a Zacharias Jansenové, Robert Hooke, Galileo Galilei a René Descartes, který tento typ mikroskopu popsal poprvé v roce 1637.
První mikroskopy měly řadu vad - zaostřovaly jen na střed zorného pole, okraje zorného pole byly ztmavlé, jejich konstrukce závisela více na náhodě, než na vědeckém podkladu. Až v roce 1869 začala spolupráce vynikajícího brusiče čoček Karla Zeisse a Ernsta Abbeho. Společně se jim podařilo sestavit základní optické rovnice mikroskopu a pomocí nich sestrojit v té době nejlepší mikroskopy na světě. Mikroskop se skládá ze dvou spojných částí. Objektiv vytváří skutečný, zvětšený a převrácený obraz blízkých předmětů. Druhá čočka, bližší k oku, okulár dále zvětšuje obraz vytvořený objektivem. Celkové zvětšení je rovno součtu zvětšení objektivu a okuláru. Kvalitní mikroskopy mají objektiv i okulár ze soustavy čoček a umožňují až 2000násobné zvětšení bez zkreslení.
Aby při pozorování mikroskopem nepřicházelo do oka rušivé postranní světlo, jsou objektiv a okulár umístěny na koncích tubusu zvaného tubus, která má začerněné vnitřní stěny. Tubus je držen stativem. Pozorovaný předmět se dává na podložnou desku s otvorem, pod nímž je umístěno osvětlovací zařízení. Obraz je možno zaostřovat pomocí šroubu, kterým se mění vzdálenost objektivu od předmětu. S dojmy současného mikroskopu se můžete setkat i v dnešních obdobách, kdy v roce 1911 Reichert sestrojil fluorescenční mikroskop s UV excitací, a v roce 1935 Zernick objevil fázový kontrast.
Od roku 60. klasický mikroskop se skládá ze tří hlavních částí: optické, osvětlovací a mechanické. Optická část obsahuje okuláry a objektivy, osvětlovací pak zdroje osvětlení, kondenzor a clonu. K mechanické části tradičně řadíme všechny ostatní prvky: stativ, revolverový nosič objektivů, pracovní stolek, zaostřovací systém a další. Správné osvětlení je pro pozorování velmi důležité, neméně jako optická kvalita mikroskopu. LED diody, halogenové žárovky, zrcátko - v mikroskopu lze použít různé zdroje osvětlení. Každý má své výhody a nevýhody. Osvětlení se dělí na horní, spodní nebo kombinované osvětlení. Pod pracovním stolkem, na který se umisťuje mikroskopický preparát, je clona mikroskopu. Může být kotoučová nebo irisová. Clona slouží k regulaci intenzity osvětlení: můžete ji použít k nastavení šířky optického paprsku, který vychází z osvětlovacího zdroje. Kotoučová clona je malá deska s otvory různých průměrů. Irisová clona se skládá z řady lamel, které lze použít k plynulé změně průměru průsvitového otvoru. Okuláry a objektivy jsou nejoblíbenější vyměnitelné součásti mikroskopu.
Optická konstrukce vytváří zvětšený obraz. Čím lepší a pokročilejší je optická konstrukce, tím ostřejší a jasnější je obraz. Optika nejvyšší kvality je však nezbytná pouze v profesionálních mikroskopech. Pro amatérský výzkum postačí standardní skleněná optika, která zajišťuje zvětšení 500x-1000x. Každý mikroskop obsahuje prvky, které badateli umožňují ovládat zaostření, upravovat polohu studovaného preparátu a nastavit pracovní vzdálenost optického přístroje.
Snažili jsme se vám sdělit, z čeho se skládá mikroskop, a ve stručnosti vás seznámit se součástmi klasického optického mikroskopu. Výrobce si vyhrazuje právo bez předchozího upozornění změnit ceny, sortiment a specifikace výrobků, případně ukončit jejich výrobu a prodej.
