Jedna z nejzákladnějších mikroskopických technik je známá jako tzv. Cílem tohoto článku je vysvětlit rozdíly mezi mikroskopem se širokým zorným polem (WF) a konfokálním mikroskopem, zejména pak rozdíly mezi zobrazováním a osvětlením mezi oběma těmito systémy.
Při mikroskopické technice WF je celý vzorek v mikroskopu vystaven světelnému zdroji (viz. obr.1).
Nejzákladnější formou WF mikroskopie je tzv. Obr.1 Konfokální vs.
V konfokálním laserovém skenovacím mikroskopu pochází světelný zdroj pro excitaci fluorescenčních barviv a proteinů z laserových jednotek, které jsou nedílnou součástí celého konfokálního systému.
Hlavní výhody konfokální mikroskopie spočívají v tom, že uživatel může definovat oblast zájmu, což vylučuje nutnost vystavení celého vzorku fluorescenčnímu světelnému zdroji.
Standardní WF mikroskopy jsou oproti konfokálním mikroskopům méně složité,, obvykle sestávají z bílého a fluorescenčního světelného zdroje, mikroskopu a kamery (s připojeným počítačem nebo bez něj).
V konvenčním laserovém skenovacím konfokálním mikroskopu může být potřeba okolo pěti různých laserových zdrojů tak, aby se pokryly excitační délky běžně používaných fluoroforů.
Například běžně používaný laser je argon-iontový laser, který může produkovat řadu excitačních vlnových délek, které jsou vybírány filtry.
Argon-iontové lasery pokrývají zelené vlnové délky excitačního spektra a jsou používány k excitaci fluoroforů, jako je FITC (fluorescein isothiocyanát).
Žluté až červené vlnové délky excitačního spektra jsou pokryty heliem-neonovým laserem, ve kterém se rozsah pohybuje přibližně od 543 do 632 nm.
Před zavedením světelných emisních diod (LED) jako fluorescenčních světelných zdrojů pro mikroskopii WF byly hlavními zdroji excitačního světla plynové obloukové lampy, které jsou dodnes široce využívány.
Dvě obloukové lampy, které se běžně vyskytují v mikroskopech WF, jsou rtuťová oblouková lampa (také označovaná jako „rtuťový hořák“ nebo „rtuťová výbojka“) a xenonová oblouková lampa.
Ve srovnání se rtuťovými výbojkami poskytují xenonové výbojky excitační vlnové délky na většině viditelného spektra, ale píky v tomto rozmezí nedosahují intenzity rtuťových výbojek.
Ačkoli tyto lampy poskytují pro fluorescenční mikroskopii extrémně intenzivní zdroje světla, mají své vlastní nevýhody.
Životnost těchto žárovek je omezena rtuťovým hořákem, který obvykle slouží cca 200 až 300 hodin a xenonovou obloukovou lampou, která má životnost 400 až 600 hodin. (i když některé systémy mají vestavěný zapisovač hodin).
Při použití plynových obloukových lamp s jejich doporučenou životností existuje nebezpečí exploze trubic.
Kromě toho, pokud jsou žárovky pravidelně zapínány a vypínány, může to výrazně zkrátit jejich životnost, což je třeba brát v úvahu.
Nová generace světelných zdrojů LED pro mikroskopii poskytuje nejen celé spektrum excitačních vlnových délek (od přibližně 365 do 770 nm), ale také poskytuje intenzitu srovnatelnou s obloukovými lampami.
Hlavní výhodou oproti obloukovým lampám je životnost zdrojů LED, které mohou být až 50 000 hodin, a to bez nutnosti zahřívání nebo ochlazování tohoto zdroje.
To samozřejmě šetří čas, protože LED jednotku je potřeba nastavit a vycentrovat pouze jednou, a sice při první instalaci tohoto zdroje.
A nakonec i odpadní teplo je problémem při používání obloukových lamp, které jsou proto instalovány do speciálního umístění vedle mikroskopu.
Jak bylo popsáno výše, konfokální skenovací hlava obsahuje řadu fotonásobičových trubic (PMT) pro sběr fotonů ze vzorku.
Konfokální skenovací hlava bude obvykle obsahovat alespoň tři PMT, které jsou zodpovědné za sběr červeného, zeleného a modrého světla.
Další PMT jsou společné pro sběr přenášeného nebo odraženého světla.
PMT nejsou fotoaparáty jako takové, ale jsou tvořeny vakuovými trubicemi, které mají na jednom konci okno pro vstup fotonů a elektronovou multiplikační komponentu v těle trubice (viz obrázek 4).
Množství shromážděných fotonů je převedeno na elektrický signál před konečným sestavením a zobrazením obrazu.
Snímání obrazu při WF mikroskopii je usnadněno konvenčnější kamerou založenou na fotodiodách (viz obrázek 4).
Digitální mikroskopické kamery obsahují polovodičové detektory.
Nejběžnějšími senzory jsou Charge Coupled Devices (CCD), Complementary Metal Oxide Semiconductors (CMOS) a sCMOS (vědecké CMOS).
Mezi kamerami CCD a CMOS existuje mnoho podobností, i když zpracovávají obrazový signál různými způsoby, které mohou následně ovlivnit dobu snímání kamery, jakož i faktory, jako je poměr signál-šum.
Snímkový kmitočet kamery založené na CCD může být 10krát pomalejší než snímač CMOS kvůli vnitřní povaze jejich funkce.
Obr.4: V konfokální mikroskopii se fotony shromažďují fotonásobičemi (vlevo).
Skládají se z vakuových trubic, které mají na jednom konci fotonové vstupní okno a složku znásobení elektronů pro zesílení.
Mikroskopické čipy kamery se skládají z milionů fotodiod (vpravo).
Hlavním složením fotocitlivé diody je fotoelektrický křemík.
Mikroskopy se širokým polem jsou buď vzpřímené, ve kterých je sklíčko osvětleno zespodu, nebo inverzní, ve kterých je sklíčko osvětleno shora, jako na obrázku 5.
Tato konfigurace má vliv na vzorek, který lze zkoumat.
Vzpřímené mikroskopy se běžně používají pro aplikace s fixními vzorky, upevněné na skleněných podložních skíčkách.
Inverzní mikroskopy byly vynalezeny pro sledování živých buněk.
Obvykle se tyto vzorky pěstují v kapalných roztocích.
Obr.5: Vzpřímený mikroskop obsahuje objektiv výše a kondenzátor pod vzorkem (vlevo).
Epi-fluorescence je termín používaný k popisu fluorescenční mikroskopie, ve které se stejná čočka (objektiv) používá k osvětlení i sběru emitovaného světla ze vzorku.
Světlo prochází ze světelného zdroje, prochází sadou filtrů, dichromatickým zrcadlem a objektivem se odráží excitační světlo s kratší vlnovou délkou.
Techniky trans-osvětlení zahrnují kontrastní metody, jako je fázový kontrast a diferenciální interferenční kontrastní (DIC) mikroskopie.
Ale Transfluorescenční mikroskopie je metoda, která není dobře známa, ani dobře používána. Tato metoda vylučuje použití dichromatických čoček a místo toho excitační světlo prochází kondenzátorem a vzorkem, a poté je emisní světlo shromažďováno objektivem.
Tato technika však měla mnoho počátečních problémů, především vysokou úroveň pozadí a potíže s optickým přizpůsobením kondenzátoru a cílů [1].
Kombinace fluorescenční WF mikroskopie a kontrastních technik může poskytnout cenné informace a obrázky životaschopnosti a morfologie.
Konfokální systém má schopnost současně snímat kontrastní i fluorescenční obrazy, které lze překrýt pomocí softwaru pro analýzu obrazu.
Ve fluorescenční WF mikroskopii však současné zobrazení jako je toto, vyžaduje použití adaptéru kamery s rozděleným pohledem, nebo použití dvou samostatných kamer, jednu pro kontrast a druhou pro fluorescenci.
Ob usually will fluorescenční snímek zachycen kamerou, následuje změna optiky na kontrastní osvětlení, a poté stejná kamera zaznamená kontrastní snímek.
Obr. Rozlišení mikroskopu je jednoduše řečeno schopnost rozlišit detaily ve vzorku.
Je to minimální vzdálenost, při které lze dva odlišné body vzorku stále považovat za samostatné entity.
Stejně jako u všech konvenčních optických mikroskopických systémů (včetně konfokálního) je rozlišení určeno numerickou aperturou (NA) a vlnovou délkou světla.
Ve světelné mikroskopii je limit rozlišení kolem 200 nm.
V dokonale zarovnaném mikroskopickém systému s nejvyšší optikou NA je limit rozlišení zhruba polovina vlnové délky světla použitého k zobrazení vzorku (nebo excitaci fluoroforů).
Skutečné rozlišení dosažené mikroskopem WF je však zhoršeno fluorescencí pozadí.
Jak je zdůrazněno výše, celý vzorek je osvětlen pod mikroskopem WF, a proto oblasti nad a pod ohniskovou rovinou také fluoreskují a budou zachyceny kamerou, což pozorovatel uvidí.
V konfokálním systému se bodová clona (uvnitř skenovací hlavy) používá k blokování jakéhokoliv světla mimo oblast zaostření v dosažení detektorů PMT.
Ačkoli to má výhodu v tom, že vytváří velice dobře zaostřený obraz blokováním pozadí a autofluorescence, některé fotony mimo zaostření mohou pocházet z ohniskové roviny.
To znamená, že některé informace by mohly být kvůli použití bodové clony ztraceny.
Mezi ostrými obrazy vytvořenými na konfokálním systému a neúmyslným shromažďováním nezaostřeného světla pomocí mikroskopu WF existuje rovnováha.
Avšak pomocí post-akvizičního procesu známého jako „dekonvoluce“ to může vyřešit rozmazání a zaostření (s. Obrázek 7).
Obnovení fluorescence po fotobělení (FRAP) je technika, která se používá ke zkoumání mobility molekul v průběhu času.
Tato technika byla původně používána ke studiu dynamiky a tekutosti lipidových molekul v buněčných membránách, ale může být také použita ke studiu proteinů v organelách nebo cytoplazmě.
Jakmile je fluorofor, který je předmětem zájmu, lokalizován, cílová oblast v buňce je záměrně (a nevratně) fotobělena, aby se vymazala veškerá fluorescence.
V průběhu času se odbarvená oblast postupně stane fluorescenční, jak se více značených cílových proteinů pohybuje do oblasti, ať už pasivně (difúzí) nebo aktivně (transportem).
Obr. 8 : Experimenty FRAP mohou poskytnout vhled do dynamiky molekul.
Definovanou oblast fluorescenčních molekul lze nevratně bělit laserem.
Ačkoli experimenty FRAP byly dříve prováděny pomocí konfokálního mikroskopu, v dnešní době existují i řešení WF.
Mikroskopické techniky s vysokým rozlišením jsou ty, které mohou zobrazovat obraz za hranicí rozlišení kolem 200 nm.
• Lokalizační techniky s jednou molekulou, ve kterých se v průběhu času shromažďují malé podíly fluoroforového signálu, aby se vytvořil konečný obraz.
• Strukturovaná světelná mikroskopie (SIM).
• Mikroskopie vyčerpání stimulovanou emisí (STED).
GSDIM / dSTORM využívá lasery a fotopřepínatelné fluorescenční sondy, které se vypínají a zapínají k vytváření obrazu v průběhu času.
Většina fluorescenčních sond je indukována do energetické úrovně „temného stavu“, při které nemohou emitovat fotony.
| 5. 9. 1. Rozsivky, křemelina ze SPR Soos, (Nomarského diferenciální interferenční kontrast, 1 až 2 optické řezy).
2. Vířník ze zooplanktonu, (autofluoreskující nativní preparát dobarvený akridinovou oranží).
3. Nervové buňky (červené) ze srdečního svalu 21 dní staré myši jsou zviditelněny protilátkou značenou texaskou červení a nervová vlákna (zelená) protilátkou značenou FITC (obraz složen z 25 optických řezů, preparát poskytla MUDr. Jana Slavíková).
4. Parazitický střevní prvok Giardia intestinalis (α-tubulin bičíků je označen protilátkou s FITC, preparát poskytla RNDr. Eva Nohýnková).
5. Hlavička plísně Mucor s hyfy a sporami.
Doc. RNDr. Josef Reischig (*1945) vystudoval Fakultu tělesné výchovy a sportu UK a Přírodovědeckou fakultu UK v Praze. V Biologickém ústavu Lékařské fakulty UK v Plzni se zabývá obecnou biologií a genetikou. Vede Referenční pracoviště optické mikroskopie firmy OLYMPUS C&S, s. r.
Už několik desetiletí si věda láme hlavu nad zvláštními, několik desítek metrů vysokými kopci rozesetými po různých částech Marsu.
Mapy jsou často vnímány jako důvěryhodné médium založené na seriózních datech. Mapy patří k nejpřesvědčivějším obrazům světa. Působí věcně a spolehlivě, nejsou však pouhým otiskem reality.
Mikroskopie patří mezi nejpoužívanější metody invazivního i neinvazivního průzkumu. Z obecného hlediska lze mikroskopii považovat za vstupní a základní metodu průzkumu a dokumentace vzorků i částí předmětů.
Mikroskopicky lze zkoumat různé druhy vzorků zahrnující úlomky, prášky, vlákna a velmi často také speciálně připravené příčné řezy (nábrusy, výbrusy).
Komplexní mikroskopický průzkum vzorků se většinou provádí pomocí badatelských polarizačních mikroskopů umožňujících fluorescenční techniky průzkumu.
Tyto mikroskopy bývají již běžně opatřeny záznamovou digitální technikou.
Mikroskopické techniky je možné úspěšně uplatnit u všech typů předmětů kulturního dědictví.
V mikroměřítku se například zkoumají optické vlastnosti nebo materiálová podstata částí studovaných předmětů a jejich povrchových úprav, maleb a polychromií, upřesňuje se typ poškození, jeho důsledků a příčin nebo se vyhodnocují úkony restaurátorsko-konzervátorského zásahu.
Mikroskopický průzkum může sloužit k identifikaci a detailnímu popisu textilních vláken, pigmentů, druhů dřev, biologického napadení, kovů, minerálů, hornin a maltovin.
tags: #podtstata #svetelne #mikroskopie