V medicíně je světelná mikroskopie jednoznačně nejčastější metodou zobrazování a studia mikrostruktury zkoumaných objektů; především tkání a buněčných kultur, ale i neživých objektů, např. implantátů. Rozlišovací schopnost světelné mikroskopie, tj. schopnost rozlišit a zobrazit nejmenší objekty, je však omezena vlnovou délkou viditelného světla - fotonů. Běžná světelná mikroskopie tak neumožňuje odlišit dva body bližší než cca 250 μm. V posledních letech se však podařilo zvýšit rozlišovací schopnost optické mikroskopie pomocí metod superrozlišovací mikroskopie, která v nejlepších případech dokáže odlišit dva body bližší než cca 60 nm. Avšak na pozorování buněčné ultrastruktury, ultrastruktury materiálů (např. lomové plochy prasklých implantátů) atp. je to stále málo. Právě proto se využívají i jiné zobrazovací metody, a to především elektronová mikroskopie.
Elektronový mikroskop je obdoba světelného mikroskopu, ve kterém jsou fotony nahrazeny elektrony a skleněné čočky elektromagnetickými čočkami. Elektromagnetická čočka je v podstatě cívka, která vytváří vhodně tvarované magnetické pole. Transmisní elektronový mikroskop zobrazuje ultrastruktury vzorku pomocí svazku prošlých elektronů. Náš transmisní elektronový mikroskop JEOL JEM-1400+, který byl do projektu vložen jako věcný příspěvek, pracuje s urychlovacími napětími 40 - 120 kV. Je tak vhodný především pro pozorování biologických vzorků (typicky při urychlovacích napětích 80 - 120 kV), ultrastruktury nanomateriálů (kvantové tečky, nano grafen, nano partikule TiO2 atp.) a tenkých materiálových vzorků, jejichž tloušťka je maximálně desítky nm. Ke generování elektronového svazku využívá mikroskop katodu LaB6, která v porovnání s klasickou wolframovou katodou dosahuje vyšší intenzity svazku a rovnoměrnějšího ozáření vzorku. Maximální garantované rozlišení mikroskopu je 0,38 nm v případě bodového obrazu a 0,2 nm u mřížkového obrazu. Mikroskop umožňuje pozorování klasických vzorků na standardních mřížkách Ø 3 mm. Je také vybaven držákem a speciální evakuační stanicí pro uchovávání a pozorování kryogenicky zmrazených vzorků.
Energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS, EDX, EDXS nebo XEDS) je analytická metoda pro prvkovou nebo chemickou analýzu vzorků, která zjišťuje složení zkoumaného vzorku, a to pomocí analýzy charakteristického záření, které vzniká interakcí vzorku s dopadajícími elektrony. Pro pozorování v transmisním elektronovém mikroskopu je potřeba připravit velmi tenké vzorky o tloušťce kolem 100 nm, aby je elektrony byly schopné prozářit a vytvořit dostatečně jasný obraz. K tomu se používá zařízení na krájení vzorků, tzv. ultra mikrotom. V našich laboratořích jsme schopni připravit a pomocí transmisního elektronového mikroskopu JEOL JEM-1400+ pozorovat nejen klasické ultratenké řezy se standardní fixací, kontrastováním a řezy pro imuno-detekci, ale také speciální vzorky zpracované velmi šetrnou metodou - kryogenickým zmrazením pro zachování maxima buněčné ultrastruktury a pro speciální imuno-detekční techniky. Přípravu takových vzorků provádíme pomocí kryo ultra mikrotomu PowerTome PCZ firmy RMC Boeckeler s kryostanicí pro krájení hluboce zmrazených vzorků. PowerTome PCZ je schopen automatického krájení vzorků o volitelné tloušťce (0 nm - 15 nm) rychlostmi 0,1 - 100 mm/s. Díky tomu lze krájet vzorky speciálně připravené v pryskyřicích nebo zmrazené, a to za pomocí skleněných nebo diamantových nožů.
Skenovací (či také rastrovací nebo řádkovací) elektronový mikroskop je další zobrazovací zařízení pro pozorování ultrastruktury povrchů zkoumaných vzorků. Pro zobrazování se používá úzký svazek elektronů, který postupně skenuje povrch materiálu a z každého místa provádí analýzu signálů pomocí sady detektorů. Náš skenovací elektronový mikroskop JSM-IT500HR/LA firmy JEOL je vybaven detektory sekundárních elektronů (SED), detektory zpětně odražených elektronů (BED) pro vysoké i nízké vakuum a EDS detektorem s SDD čipem, aktivní plochou 30 mm2 a rozlišením 129 eV s detekcí prvků od Be po Pu. Mikroskop umožňuje pozorování vzorků ve vysokém i v nízkém (min. do 150 Pa) vakuu. Dosahuje rozlišení ≤1,5 nm při urychlovacím napětí 15 kV ve vysokém vakuu (řádově 10-6 - 10-7 Pa) a ≤ 1,8 nm při urychlovacím napětí 15 kV při nízkém vakuu (do 150 Pa).
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) a její varianty umožňují studovat vnitřní struktury vzorků a, při vysoké rozlišení, i jednotlivé atomy. High Resolution TEM (HRTEM) zobrazuje atomové sloupce při vhodné orientaci vzorku, což omezuje možnosti pozorování, ale vyniká schopností zobrazit atomární uspořádání. Obr.6 ukazuje mikrostrukturu slitiny Al-3%Mg-0,2%Sc v TEM světlém poli; obrysy zrn a jejich krystalové orientace jsou vidět jako oblastí se shodnou orientací. První použitelný SEM byl konstruován v roce 1942, první komerční SEM v roce 1965.
V naší laboratoři jsou realizovány in-situ experimenty v TEM, kdy je vzorek ohříván či natahován přímo v mikroskopu a změny sledujeme kamerou. Obrázek ukazuje in-situ plastickou deformaci slitiny Fe-3%Si při pokojové teplotě, s narůstajícím počtem dislokací a hranicí zrna.
Řádkovací elektronové mikroskopy (SEM) lze obohatit o dvousvazkové varianty SEM-FIB, které kombinují elektronový a fokusovaný iontový svazek a umožňují detailní analýzu povrchů i nástřiků. Nanodráty ze Si (PECVD) s délkou až několik tisícin milimetru a průměrem 10-100 nm ukazují potenciál pro senzory s velkou aktivní plochou a pro konverzi energie v solárních článcích. Diamantové vrstvy připravené technologií MWPECVD vykazují výjimečné vlastnosti pro biokompatibilitu a povlakování implantátů.
Vysoká rozlišovací schopnost elektronové mikroskopie umožnila vývoj směru 3D analýzy molekulárních struktur. Tým elektronové mikroskopie a mikroanalýzy disponuje detektory pro topografické i krystalografické zobrazení a mikroanalytickými spektrometry (EDS, WDS) pro chemickou analýzu. Laboratoř má kompletní vybavení pro přípravu vzorků pro elektronovou i optickou mikroskopii a zaměřuje se na topologii, morfologii, chemické a fázové složení materiálů, popř. na korelativní mikroskopii.
Většinu výše uvedených metod lze shrnout jako cestu od optické k elektronové mikroskopii, která umožňuje dosahovat rozlišení na úrovni nanometrů a dokonce atomů. Obr./schémata znázorňují jednak obecný princip interakce elektronů se vzorkem, jednak rozlišení a formy zobrazení v TEM a SEM. Zároveň je zřejmé, že vývoj v oblasti elektronové mikroskopie je úzce propojen s pokroky ve vitrifikaci vzorků, kryo-technologiích, a s rozvojem detektorů a analytických metod, které umožňují chemickou mikroanalýzu a určování krystalografických orientací.
Obecně platí, že elektronové mikroskopy patří mezi nejvšestrannější přístroje pro pohled do mikrosvěta a poskytují komplexní informaci o mikrostruktuře, krystalografii, chemickém složení i dalších vlastnostech vzorku. Obraz vzniká v důsledku interakce elektronového svazku se vzorkem a výsledný signál (sekundární, zpětně odražené elektrony, rentgenové záření) se používá k různým typům analýz, včetně EDS/EDX a dalších detektorů pro studium materiálů a biomateriálů.
Souhrn klíčových koncepcí
- Rozlišení elektronových mikroskopů je omezeno na základě vlnové délky záření; elektronové záření umožňuje podstatně vyšší rozlišení než viditelné světlo.
- TEM a SEM představují dvě hlavní kategorie elektronové mikroskopie s různými aplikačními doménami: tenké vzorky pro TEM a povrchová zobrazení pro SEM.
- Kryo-elektronová mikroskopie a vitrifikace významně urychlily pozorování biomolekul v jejich native prostředí, umožňující 3D rekonstrukce a analýzy na molekulární úrovni.
- Analytické detektory (EDS, WDS) a mikroanalýza umožňují určovat chemické složení vzorků, včetně prvkové detekce ve velkém spektru prvků.
- In-situ techniky v TEM umožňují sledovat dynamiku materiálů za provozu, což napomáhá porozumění mechanickým a termálním procesům na mikroskopické úrovni.
tags: #pozlaceni #elektronova #mikroskopie