Transmisní i skenovací elektronový mikroskop (dále TEM a SEM) byly od svého počátku využívány pro výzkum biologických objektů, přestože biologické vzorky nejsou pro pozorování v elektronových mikroskopech nejvhodnější. Mají vysoký obsah vody, který je neslučitelný s vakuem vnitřních prostorů mikroskopů, a v jejich hmotě převažují lehké atomy, což vede k nedostatečné interakci a rozptylu energetických primárních elektronů. Proto se musí biologické preparáty zbavovat vody a do jejich struktury se musí přidávat atomy těžkých kovů. Tato příprava vzorků je často příčinou výrazných změn.
Elektronová tomografie a prostorové zobrazení
Transmisní elektronová mikroskopie: řada novinek se objevilo v transmisní elektronové mikroskopii. Elektronoví mikroskopici odjakživa snili o prostorovém zobrazení pozorovaných objektů, ať už šlo o buňky, molekuly či technické materiály. Skenovací elektronová mikroskopie umožňuje náhled pouze na povrch struktur, klasická prozařovací elektronová mikroskopie umí pracovat jen s tenkými řezy, jejichž příprava je obtížná a skládání výsledného obrazu nepřesné. Nedávno se však objevily komerčně dostupné přístroje, jež zvládají prostorový pohled dovnitř zkoumaných útvarů. Využívají tomografii - metodu založenou na sběru obrazu při otáčení preparátem a následné počítačové rekonstrukci. Během necelé desítky let vyzrála elektronová tomografie do uživatelsky přátelské metody, kterou může používat každý zkušenější mikroskopik.
Systém pracuje takto: 1) prozařovací elektronový mikroskop s dostatečným urychlovacím napětím, 2) výkonný počítač. V mikroskopu je vestavěn nesmírně přesný držák preparátu, který se dokáže otáčet bez významných otřesů a posuvů po malých krocích od -70° do +70°. Celý proces (otáčení držáku, kontrola parametrů zobrazení při každém kroku, snímání jednotlivých obrázků) je plně automatizován. Typická sada postupně pořízených tomografických snímků obsahuje asi 140 záběrů získaných digitální kamerou za 20 minut (obrázek A). Počítačové zpracování začíná přesným „napasováním“ jednotlivých obrázků nad sebe pomocí složitých matematických (plně automatizovaných) postupů (obrázek B). Poté práci přebírá software, jenž vytvoří přesnou prostorovou rekonstrukci struktur, které nás zajímají (C). Tímto způsobem lze rekonstruovat například buněčné organely.
Dalším velkým příslibem pro budoucnost studia materiálů tvořených lehkými prvky, kam patří i biologické objekty, se zdá být nízkonapěťový elektronový mikroskop, jehož autorem je Armin Delong. Jde o nový unikátní přístroj, který vznikl kombinací optického a elektronového mikroskopu. K velmi příjemným vlastnostem mikroskopu patří i schopnost pracovat při nízkém urychlovacím napětí 5 kV. Důsledkem této skutečnosti je vysoký kontrast výsledného obrazu (obrázek), umožňující vynechat v přípravě preparátů kontrastující procedury. Nevýhodou je, že takto urychlené primární elektrony mají nízkou penetrační schopnost. Proto se musí připravovat vzorky v podobě ultratenkých řezů s tloušťkou okolo 20 nm.
Nejméně polovinu úspěchu představují v elektronové mikroskopii biologických objektů dobře připravené preparáty. V posledních letech nastupují kryometody, které fi xují vzorek ve zlomku vteřiny a bez význačných změn vůči nativnímu stavu. Stále častěji se využívají pro imunolokalizace buněčných složek (metoda Tokuyasu), protože lépe zachovávají schopnost tkáně vázat antigeny a zároveň zlepšují přístup protilátek k vazebným místům.
Skenovací elektronová mikroskopie a prostředí
Na názorném příkladu se podívejme, co snahy o přiblížení se nativnímu stavu při pozorování biologických vzorků přinesly ve skenovací elektronové mikroskopii. Svěrací průduchové buňky z povrchu blahovičníkového listu na sebe upozornily „nepatřným“ chováním při prohlížení ve vysokovakuovém SEM. Povrch blahovičníkového listu jsme si prohlédli pomocí environmentálního skenovacího elektronového mikroskopu. Tento mikroskop má vnitřní prostor tubusu rozdělený do kaskády komor, v nichž stoupá tlak. Poměry v preparátové komoře proto dovolují prohlížet vzorek obsahující vodu. Cestu sekundárních elektronů k detektoru navíc zprostředkovává ionizace zbytkových molekul plynu, která také eliminuje náboje na povrchu preparátu, a vzorek není třeba pokrývat vodivou kovovou vrstvou.
Ani tento mikroskop nám ale neumožnil odhalit tajemství průduchových svěracích buněk. Důkladně prozkoumat dutinu před průduchy a určit příčinu nabíjení svěracích buněk se nám podařilo až pomocí SEM s autoemisní tryskou. Tento typ mikroskopu dosahuje vysokého rozlišení i při nízkém urychlovacím napětí, protože je zmenšen průměr primárního svazku elektronů. Byla vybavena kryo-nástavcem pro pokovit a pozorovat zmražený preparát. Zapojte dva typy vývěv do série, abyste získali vakuum v trubici elektronového mikroskopu. Jinak budou molekuly ve vzduchu bránit emisi elektronového paprsku a zobrazování.
Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) se vyvíjí směrem k vyššímu detailu a lepšímu porozumění povrchové morfologie. Při ní se vzorek v komoře nachází pod různými tlaky, a to zejména v environmentálním módu. V nízkovakuových mikroskopech se ke tvorbě obrazu používají odražené elektrony, které mají dostatečnou energii a rychlost, aby dorazily k detektoru. V environmentálním SEM se využívají sekundární i odražené elektrony, které ionizují molekuly plynu a uvolněné elektrony přenášejí signál do detektoru. Cenou za možnost prohlížet zavodněné preparáty je snížená rozlišovací schopnost. Obrázky rozsivky ukazují tři módy, které využívají sekundární a odražené elektrony v environmentálním SEM.
Obecně platí: mikroskopy vyžadují vakuum, aby nebyla narušena dráha elektronového paprsku a aby nebyl vzorek ovlivněn atmosférou. Při dopadu elektronů na vzorek vznikají signály nesoucí informace o vzorku. Elektronové mikroskopy se dají rozdělit na TEM a SEM. TEM umožňuje průchod elektronů vzorkem, vyžaduje tenké vzorky a vysoké energie, SEM sleduje odražené elektrony a vytváří povrchový obraz. Vysoké rozlišení a tvar obrazů závisejí na nastavení vakua a konstrukci mikroskopu.
Historie a průmyslové využití
Historie elektronové mikroskopie v Brně se začala psát v roce 1947, kdy byly do tehdejšího Československa dodány první dva elektronové mikroskopy. Tým pod vedením Aleše Bláhy a Armina Delonga sestrojil první československý komerčně dostupný elektronový mikroskop Tesla BS 241, na něj navázal stolní Tesla BS 242 a světová porota EXPO 1958 v Bruselu jejich výkon ocenila. Dnes v Brně působí výrobci Thermo Fisher Scientific, Tescan a Delong Instruments, kteří ročně vyrobí kolem 700 kusů těchto přístrojů. Ústav přístrojové techniky AV ČR a jeho tým Environmentální elektronové mikroskopie posouvají hranice pro zobrazování neupravených, vlhkých a kapalinových vzorků v EREM, vyvíjejí detektory, metodiky a aplikace pro širokou škálu objektů.
Mezi významné činnosti patří vývoj metod pro pozorování živých vířníků při vysokém tlaku plynů a nízké teplotě, což umožnilo jejich taxonomickou klasifikaci a identifikaci dvou nových druhů. Dále je vyvíjena vysokorozlišovací metoda pro morfologii rostlin v jejich přirozeném stavu a vysoce účinný detektor signálních elektronů pro EREM. Těmito technologiemi se rozšiřují možnosti biologie, medicíny, archeologie a dalších oborů, a to díky unikátním EREM systémům AQUASEM II a QUANTA 650 FEG. Teoreticky a prakticky tak vzniká široká škála možností zkoumání vzorků v jejich přirozeném stavu i za radiačního zatížení.
Vliv vakua na kvalitu zobrazování a typy systémů
V běžných elektronových mikroskopech musí být v komoře téměř dokonalé vakuum - tlak je velmi nízký, aby srážky elektronů s plynovými molekulami nepřerušovaly obraz. Mikroskop s wolframovou katodou vyžaduje vakuum kolem 10^-2 až 10^-3 Pa, a k dosažení a udržení této hodnoty postačí dvoustupňový čerpací systém. V některých zařízeních dochází k výměně preparátů bez zavzdušnění komor díky vakuové propustě. V posledních deseti letech se objevily nízkovakuové a environmentální SEM, které umožňují pozorování vzorků obsahujících vodu až do tlouštěk 70-90 %. Vnitřní prostor těchto mikroskopů je rozdělen do více komor s různým tlakem; vzorek získává obraz podle odražených i sekundárních elektronů a ionizovaných plynů, což zvyšuje možnosti zobrazení v přirozeném prostředí, ale snižuje rozlišovací schopnost.
Celkově tedy vakuum není jen technickou podmínkou, ale klíčovým faktorem ovlivňujícím detekci, rozlišení a možnosti pozorování v elektronové mikroskopii. Důležitá je rovnováha mezi dostatečným vakem pro bezproblémový průchod elektronů a zároveň tolerancí vůči vodnatým vzorkům, zvláště v environmentálním SEM a při kryometodách. Bez vakuového prostředí by nebylo možné zajistit stabilní proudění paprsku a čistou detekci signálů.
Praktické poznámky a doporučení pro laboratorní práci
Nejdůležitějšími faktory pro úspěšné pozorování jsou kvalitní preparáty, vhodné volby vzorků, nastavení vakuových stupňů a volba správného režimu mikroskopu. U biologických vzorků je klíčové zvolit metody kryo-zachování a minimalizovat změny v jejich struktuře. Pro imuno-lokalizaci je důležité zvolit metodu Tokuyasu, která zachovává antigeny a zlepšuje pronikání protilátek. Při používání environmentálních technik je nezbytné řídit tlak a sledovat signály z ionizovaného plynu pro kvalitní zobrazení.
Další položkou je úvaha o nábehu a údržbě vakua, kterou zajišťují vyspělá zařízení, čerpadla a vakuové systémy. Obsluha vyžaduje vysoké odborné znalosti a zodpovědnost za bezpečný provoz a přesnost měření. Závěrem lze říci, že moderní elektronová mikroskopie vyžaduje integraci mechanických, elektronických a softwarových komponent a mezioborovou spolupráci pro dosažení co nejrealističtějšího zobrazení nanosvěta.
