Superrozlišovací mikroskopie a STORM/N-STORM: přehled technik, principů a praktických aspektů

N-STORM používá stochastickou aktivaci relativně malého počtu fluoroforů za velmi nízké intenzity světla. Tato náhodná stochastická „aktivace“ fluoroforů umožňuje časové oddělení jednotlivých molekul, čímž se dosahuje vysoké přesnosti Gaussovského fitu pro každý fluorofor v rovinách XY. Pomocí speciální 3D-STORM optiky lze lokalizovat jednotlivé molekuly i podél osy Z s vysokou přesností. Pomocí cylindrické čočky, která asymetricky koncentruje paprsky ve směru X nebo Y, lze polohu molekul v ose Z určit s přibližnou přesností kolem 50 nm. Polohu v ose Z určuje orientace protažení způsobeného astigmatismem a velikost out-of-focus bodových obrazů.

Různé typy aktivátor-reporter párů a značek bez aktivátoru jsou k dispozici. Přístup aktivátor-dye páru poskytuje konzistentní přesnost lokalizace mezi kanály díky využití stejného reporter dye pro různé kanály. Každý pár dye se skládá z aktivačního dye a reporter dye, přičemž aktivátor reguluje aktivaci reporter dye. Pro konvenční světelnou mikroskopii omezuje difrakční bariéra rozlišení na přibližně 250 nm, ale moderní high‑end techniky dosahují významného zlepšení.

Paleta vysokorozlišovacích technik zahrnuje jednou-molekulární lokalizační mikroskopii (PALM) a STORM, mikroskopii strukturovaného osvětlení (SIM) a mikroskopii se stimulovanou emisní deplecí (STED). Každá metoda má své výhody a nevýhody - výběr závisí na konkrétním projektu a na požadavcích kontextu biozobrazování, jako jsou prostorové a časové rozlišení, fototoxické citlivosti, kapacita značení, tloušťka vzorku a autofluorescence.

V kontextu PALM a STORM je v daném okamžiku excitována jen malá část fluorescenčních markerů, což umožňuje jejich nezávislou lokalizaci s vysokou přesností. Stefan Hell poznamenává, že PALM/STORM bývá relativně snadno nastavitelný, ale obtížný na aplikaci, protože fluorescenční skupina musí mít schopnost fotoaktivace. STED používá laserový puls k excitaci fluoroforu a prstencový laser k zhášení emise, čímž zůstává pouze střední fluorescence o nanometrické velikosti.

Parametrické srovnání ukazuje, že SIM zdvojnásobuje rozlišení na ~100 nm, PALM/STORM dosahují kolem 15 nm, zatímco STED poskytuje prostorové rozlišení kolem 30 nm ve živých buňkách a 15 nm v pevných vzorcích. Rychlost pořízení bývá zásadní zejména pro živé buňky; všechny techniky jsou pomalejší než konvenční metody. PALM/STORM bývá nejpomalejší, vyžaduje desítky tisíc snímků pro jeden obraz; SIM potřebuje jen desítky snímků, STED pak rychlost pořízení závisí na velikosti zorného pole.

Další vývoj se zaměřuje na dynamiku biologických systémů v živých buňkách - PALM se často kombinuje se sledováním jednotlivých částic pro pozorování dynamiky markerových molekul. V roce 2017 Hellův tým oznámil MINFLUX s prostorovým rozlišením 1 nm, který dokáže sledovat jednotlivé molekuly v živých buňkách až 100krát rychleji než jiné metody. Shechtman poukazuje na dvě klíčové oblasti: MINFLUX a práce Moernera a Stanfordské univerzity, které posouvají možnosti z hlediska přesné molekulární polohy a 3D zobrazování.

O fluorescenčních štítcích: Miltenyi spolupracuje s Abberior a poskytuje konjugaci protilatek pro mikroskopii s vysokým rozlišením; Nano-Boostery ChromoTexu (1,5 kDa) jsou malé nanobody s vysokou specifikou a stabilitou, vhodné pro SIM, PALM, STORM a STED. Zhang a kolegové použili ChromoTek GFP-Booster spolu se STORM k zkoumání šíření informací v nervovém systému a našli nanokolasy v presynaptických a postsynaptických neuronech, což svědčí o jednoduchých principech pro udržení synaptické účinnosti.

Historie a kontext optické mikroskopie: konvenční difrakční hranice byla stanovena Abbeovou teorií, která definuje limit rozlišení mezi 200-250 nm. V 20. století se rozvíjely elektronové mikroskopy, které umožnily zobrazovat detaily menší než 200 nm, avšak vyžadovaly fixované vzorky a nevhodné pro živé buňky. Nové techniky začaly obcházet difrakční bariéru pomocí triků větší sofistikovanosti; STED a STORM přinesly skutečné 3D/dimensionalitu a vyšší rozlišení. STED využívá koláčovitého deplečního paprsku a astigmatické detekce nebo interferometrie pro 3D rekonstrukci, zatímco STORM a PALM spoléhají na postupnou aktivaci jednotlivých fluoroforů a jejich lokalisaci s vysokou přesností.

Vzdělávací kontext a praktické poznámky: 3D-STORM se opírá o detekci astigmatismu, využívání cylindrické čočky a dvojitých objektivů pro vysoce přesnou detekci v ose Z; moderní systémy mohou používat glycerinové imerzní objektivy pro snížení aberací a zlepšení kvality obrazu. Značení a konjugace markerů hrají klíčovou roli v kvalitě signálu a srozumitelnosti dat, zejména při práci s živými vzorky a v neurobiologických aplikacích, kde je vyžadována vysoká autofluorescence citlivost a minimální fototoxičnost.

Význam Nobelových cen a vývojových milníků v oblasti optické mikroskopie připomíná, že postupy jako STED, PALM/STORM a MINFLUX nadále posouvají hranice toho, co je možné zobrazit v biologických vzorcích, a otevírají nové možnosti pro porozumění buněčné architektuře a dynamice.

Praktické shrnutí technik: STED - konfokální s koláčovitým deplečním laserem; STORM/dSTORM - stochastická aktivace malého počtu fluoroforů; PALM - aktivace genově cílených fluoroforů; SIM - strukturované osvětlení; MINFLUX - extrémně vysoké rozlišení až kolem 1 nm a rychlé sledování v živých buňkách. Každá metoda má unikátní aplikační výhody pro studium buněčných struktur a dynamiky, a volba techniky by měla vycházet z konkrétního vzorku, požadovaného rozlišení a potřeby dynamiky mimo jiné.

Obecné principy volby technologie: prostorové a časové rozlišení, citlivost na fotopoškození, kapacita značení, tloušťka vzorku a fluorescence pozadí jsou klíčové faktory, které je třeba zvážit při výběru metody pro biozobrazování. V praxi se často používá kombinace technik, aby se získaly doplňující informace o struktuře a dynamice buněk.

Tabulka shrnující klíčové rozlišení a charakteristiky:

tags: #superrozlisovaci #mikroskopie #storm