Mikroskop je optický přístroj umožňující rozeznat struktury, které nejsou viditelné pouhým okem. Jeho součástí je optická soustava, osvětlovací soustava a mechanické zařízení. Mikroskop zvětšuje zorný úhel. Zorný úhel je úhel, který svírají okrajové paprsky předmětu zobrazeného na sítnici. Pokud se zvětší zorný úhel, zvýší se schopnost odlišit od sebe dva body.
Předmět se umisťuje před ohniskovou rovinu objektivu. Objektiv vytvoří skutečný, zvětšený a převrácený obraz y′, který se nachází za ohniskovou rovinou objektivu. Okulár funguje jako lupa, která zobrazuje obraz y′ pod zvětšeným zorným úhlem τ′. Aby oko nemuselo akomodovat, je mikroskop nastaven tak, že obraz y′ leží v ohniskové rovině okuláru. Vlastní zobrazení předmětu zprostředkovává objektiv a okulár se společnou optickou osou. Je spojná soustava čoček umístěná blíže pozorovanému předmětu. Objektiv má malou ohniskovou vzdálenost (1,5-20 mm).
Předmět umístěný těsně před ohnisko objektivu (F1) je zobrazen objektivem do vzdálenosti, která je větší než dvojnásobná ohnisková vzdálenost objektivu. Tento obraz předmětu je převrácený, skutečný a zvětšený. Obraz může být zvětšen až 150×. Nachází se blíže oku. Je to spojná soustava čoček, která je nastavena tak, aby sloužila jako lupa. Obraz vytvořený objektivem je promítán mezi okulár a jeho ohnisko (F2). Soustava čoček tento obraz zvětšuje (až 20×). Ohnisková vzdálenost je 10-50 mm. Nezvětšuje již rozlišovací schopnost mikroskopu. Ohnisko objektivu (F1) a okuláru (F2) spolu nesplývají, ale jsou od sebe vzdáleny. Tato vzdálenost se nazývá optický interval (Δ).
Celkové zvětšení mikroskopu je dáno násobkem příčného zvětšení objektivu a úhlového zvětšení okuláru (lupy). Příčné zvětšení vyplývá z podobnosti trojúhelníků. Maximální zvětšení optického mikroskopu však nemůže přesáhnout 2000. Tímto termínem se rozumí schopnost objektivu zachytit co nejširší úhel paprsků. Je schopnost mikroskopu odlišit od sebe 2 body. Závisí na vlnové délce použitého světla, indexu lomu prostředí (možné využití imersního oleje, který zvýší index lomu) a samozřejmě na vlastnostech objektivu.
Práce s mikroskopem zahrnuje mikroskopické preparáty. Preparáty jsou obvykle naneseny na průhledném sklíčku, které je prosvětlováno konkrétním světlem, a my potom můžeme vidět dané preparáty v okuláru. Metoda světelného pole je, kdy dochází k prosvícení preparátu, a my ho vnímáme jako objekt s tmavými obrysy, který se vyskytuje ve světlém poli. Může docházet i k odražení paprsků, které pak vstupují do objektivu. Metoda temného pole je svým způsobem opakem výše uvedené metody: předmět pozorujeme jako světlý předmět ve tmavém poli. Další metodou, která je velmi používaná, zvláště v pozorování biologických preparátů, je metoda fázového kontrastu.
Struktury, které chceme v preparátu pozorovat, se zpravidla liší svým indexem lomu od okolí. Po světle projde skrz objektiv a následně okulár, dostáváme zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz. Maximální zvětšení optického mikroskopu ovšem nemůže přesáhnout 2000. Tímto termínem se rozumí schopnost objektivu zachytit co nejširší úhel paprsků. Je schopnost mikroskopu odlišit od sebe 2 body. Závisí na vlnové délce použitého světla, indexu lomu prostředí (možné využití imersního oleje) a samozřejmě na vlastnostech objektivu.
U dalekohledů je důležitý průměr objektivu, který ovlivňuje jas a ostrost obrazu. Optický (nebo také světelný) mikroskop je zařízení, které používáme k pozorování předmětů, které nejsme schopni spatřit pouhým okem, tj. předmětů, které mají velikost menší než 0,2 mm. Jeho rozlišovací schopnost (schopnost odlišit od sebe dva body) je tedy 0,2 mm - 0,2 μm. Pro menší předměty musíme použít mikroskop elektronový, který rozliší předměty až do velikosti 0,1 nm. Tedy předměty o tři řády menší, než zvládá rozlišit mikroskop světelný.
Již ve starověku byly používány různé čočky na pozorování předmětů, které byly příliš malé na pozorování pouhým okem. První velký objev se ovšem datuje do 17. století, kdy Anton van Leeuwenhoek vynalezl přístroj, který se skládal z šroubku, kovového plátku, drážky na upevnění předmětu a sférické čočky. Tento přístroj se dnešnímu mikroskopu nepodobal, je ovšem až obdivuhodné, že jím bylo možné dosáhnout neuvěřitelného zvětšení až 250-500×. K dalšímu přelomovému objevu dospěl Robert Hook, který jako první začal pracovat se světlem v mikroskopii.
Nejdůležitější částí optického mikroskopu je objektiv. Jedná se o soustavu obvykle několika čoček, které dohromady fungují jako spojná čočka. Předmět, který v mikroskopu pozorujeme musí být umístěn ve vzdálenosti mezi f a 2f, tak bude obraz skutečný, zvětšený a převrácený. V praxi má objektiv malou ohniskovou vzdálenost (v řádu milimetrů), proto poskytuje větší zvětšení než okulár, jehož ohnisková vzdálenost se volí větší (v řádu centimetrů). Objektiv určuje zvětšení a kvalitu výsledného obrazu (čím kvalitnější obraz požadujeme, tím kvalitnější objektiv musíme použít).
Okulár, jak již název napovídá, je část mikroskopu, do které pozorovatel hledí (z latinského oculus = oko). Podobně jako objektiv se také skládá ze soustavy čoček, kterých je ale oproti objektivu méně. Tyto čočky společně opět fungují jako spojná čočka a poskytují zdánlivý, zvětšený a přímý obraz. Kromě objektivu a okuláru nalezneme v mikroskopu ještě další opticky důležitý systém, kondenzor. Jedná se o soustavu čoček nebo zrcadel, které soustřeďují paprsky na pozorovaný objekt a zajišťují tak jeho osvětlení. Každý, kdo začíná pracovat s mikroskopem, dříve či později narazí na nějaké potíže. To je zcela pochopitelné a je to tak v pořádku.
Jaké zvětšení vlastně potřebuji? Je zorné pole pro mě nějak důležité? Proč potřebuji dodatečné okuláry? Pro vzdělávání se používají typy se třemi až čtyřmi objektivy (4x, 10x, 40x, případně 100x s olejovou imerzi). Celkové zvětšení s okulárem 10x a objektivy 4x, 10x, 40x, 100x je 40×, 100×, 400× a 1000×. Hlavními typy okulárů bývají Huygensův (dva ploskovypuklé čočky) a Ramsdenův; pro náročnější účely existují periplantické nebo ortoskopické. Tubus má typickou optickou délku 150-200 mm. Dioptrická úprava umožňuje zaostřit jeden okulár nezávisle na druhém. Zorné pole je průměr osvětleného kruhu pozorovaného přes okulár; vyšší zvětšení snižuje zorné pole.
Pro měření a kalibraci se používá nitkový kříž a stupnice na stojanu. Celkové zvětšení se počítá jako součin zvětšení okuláru a objektivu. Přehledně: 4×, 10×, 40× a 100× objektivy vedou k odpovídajícím celkovým zvětšením. U stereoskopických mikroskopů je princip obdobný, avšak používají se jiné objektivy s variabilním zvětšením. Mikro- a macrošroub slouží k jemnému zaostření. Výběr světlého zdroje a kondenzoru ovlivňuje osvětlení; polarizátor může být součástí osvětlovací soustavy pro práci v polarizovaném světle.
Objektiv vytváří zvětšený a převrácený obraz, který okulár dále zvětšuje a promítá do oka. Proces optické optiky zahrnuje imerzní olej pro vyšší NA, který zvyšuje rozlišovací schopnost, avšak vyžaduje precizní techniku a je nákladný. Maximální rozlišení světelného mikroskopu bývá kolem 2000×. Pro pozorování bakterií je nutný mikroskop s alespoň 1200× zvětšením a speciální metody přípravy vzorku a barvení.
Další poznámky: pro běžné pozorování se používají 3-4 objektivy se zvětšením 4×, 10× a 40×, u některých modelů také 100×. K fotografování lze použít integrované fotoaparáty nebo adaptéry pro připojení digitálních zrcadlovek. Předměty pronikají do zrakového pole díky ohniskovým vzdálenostem a vzdálenostem f a 2f; při vhodném rozměrovém uspořádání vznikne obraz skutečný, zvětšený a převrácený.
Optické intervaly mezi ohniskem objektivu a ohniskem okuláru označují optický interval Δ; jde o důležitou veličinu pro vymezení vzájemné vzdálenosti optických členů a pro stabilitu a ostrost obrazu.
Často používané nabídky a varianty microsoportům pro vzdělávání zahrnují standardní trojici objektivů 4x, 10x a 40x, s maximálním výkonem až 400×; pokročilejší modely nabízejí 100× pro olejovou imerzi a dosažení až 1000× při použití okuláru 10×. Při 1000× zvětšení je možné pozorovat detaily na úrovni malých buněk, avšak ostrost a zaostření bývá náročnější a vyžaduje pečlivou techniku a správné sklady vzorků. Pro běžné vzdělávací účely tedy stačí 3 objektivy s 400× celkovým zvětšením, zatímco pokročilé požadavky mohou zahrnovat 1000× s olejovou imerzi.
Achromatické objektivy redukují sférické a chromatické aberace; planachromatické objektivy nabízejí ploché zorné pole a velmi ostrý obraz po celém záběru. Semiapochromatické objektivy poskytují průměrnou úroveň kvality obrazu. Apochromatické objektivy poskytují ostřejší obraz ve jasnějších barvách. Pro amatérský mikroskop není možné pozorovat bakterie bez vhodného zvětšení a barvení vzorku; taková pozorování vyžadují výkonnější mikroskop a speciální metody zpracování vzorku.
Podstatné mechanické části zahrnují stativ a stolek, makro- a mikrošroub pro jemné ostření a přesné posuny preparátu. Mikroskopy jsou určeny k pozorování velmi malých objektů, například buněk nebo mikroorganismů, a skládají se z objektivu s krátkou ohniskovou vzdáleností a okuláru. Osvětlení zajišťuje intenzivní zdroj světla, často doplněný kondenzorem. Dalekohledy slouží k pozorování vzdálených objektů a nevyžadují další osvětlení; mají objektiv s dlouhou ohniskovou vzdáleností a okulár, který obraz zvětšuje.
Osvětlení, zorné pole a zkoumání detailů
Dalekohledy využívají přirozené světlo z pozorovaných objektů a nevyžadují dodatečné osvětlení. Z fyzikálního pohledu je u mikroskopů klíčová numerická apertura (NA), která určuje schopnost rozlišit jemné detaily. Větší NA zlepšuje rozlišení, ale zmenšuje hloubku ostrosti, což znamená, že zaostřena je jen tenká vrstva vzorku.
Objektiv vytváří skutečný a zvětšený obraz, který okulár dále zvětšuje. Obraz vzniká mezi objektivem a okulárem; optický interval Δ hraje klíčovou roli ve stabilitě a kvalitě obrazu. Pro běžná pozorování stačí standardní tubus a základní okuláry; pro přesné měření se používají mikrometrické stupnice a kalibrace.
Na závěr: optický mikroskop s kombinací objektivu a okuláru umožňuje pozorovat vzorky v rozsahu zrnění od buněk až po některé mikroorganismy, ale jeho limity dané NA a vlnovou délkou světla určují, co je možné rozlišit. Proto se výběr objektivu, ohniskové vzdálenosti a použití olejové imerze volí podle konkrétního účelu pozorování a požadovaného detailu.