Na rozdíl od snímání klasickou metodou fluorescenční mikroskopie v režimu widefield je u konfokální mikroskopie potlačen signál ze vzorku, který pochází z oblasti mimo ohniskovou rovinu. Díky tomu lze pozorovat preparáty o větší tloušťce při zachování kontrastu a vysokého poměru signálu vůči šumu. Na konfokálním mikroskopu vybaveném detektorem nebo kamerou a pracovní stanicí s příslušným software (Imaris) je pak uživatel schopný digitálně rekonstruovat trojrozměrný model celého preparátu (3D vizualizace).
Obrázek 1:. Nevýhodou laserové skenovací konfokální mikroskopie je soustředění velice intenzivního laserového paprsku na každý zobrazovaný bod (pixel). Tím je preparát dlouhodobě vystaven toxickým účinkům světla. Navíc je nutné, aby světlo z laserového paprsku dopadlo na všechny snímané body postupně, z čehož vyplývá výrazné omezení rychlosti snímání, především při vysokém rozlišení (např. 2048 x 2048 pixelů).
Potlačení signálu z oblasti mimo ohniskovou rovinu se provádí díky použití tzv. rotujícího disku (Petráňův/Nipkowův disk, spinning disk). Obrázek 2:. Widefield (vlevo), konfokální mikroskopie (vpravo). Jedna optická rovina (60× 1.2 NA). Obrázky pořízené v režimu widefield obsahují signál z oblasti mimo ohniskovou rovinu. Konfokální mikroskop na bázi rotujícího disku poskytuje ostrý obraz z jedné ohniskové roviny s více detaily a také s vyšším kontrastem a dynamickým rozsahem. Konfokální mikroskopie na bázi rotujícího Petráňova/Nipkowova disku (spinning disc) dosahuje velmi rychlého snímání obrazu o vysokém rozlišení. Excitační optická dráha vede skrz tzv. rotující disk obsahující vysoké množství “pinholes”, které zajišťují konfokalitu získaného obrazu (Obrázek 3.).
Již při pootočení disku o několik stupňů dosáhneme pokrytí celého zorného pole (rychlosti se pohybují kolem 6000 otáček za minutu - Dragonfly). Fotografie konfokálního mikroskopu v zatemněné místnosti. Při pozorování reálného preparátu, jehož tloušťka není zanedbatelná, je pozorování zkresleno paprsky vycházejícími z hmoty nad a pod zaostřenou rovinou. Tomuto nepříznivému efektu zabraňuje právě využití konfokálního mikroskopu.
Idea konfokálního mikroskopu pochází od Marvina Minského, který si ji patentoval již r. 1957. V té době však zůstala bez odezvy, neboť Minsky nenašel vhodný zdroj světla pro konstrukci funkčního přístroje. O deset let později M. Petráň a M. Hadravský z Lékařské fakulty UK v Plzni patentovali konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče. S tímto přístrojem byl Tandem Scanning Confocal Microscope poprvé použit pro získání kvalitních optických řezů silným preparátem, konkrétně mozkovou tkání. Tandemový konfokální mikroskop však nedoznal většího rozšíření v praxi. Éra konfokální mikroskopie začíná až koncem sedmdesátých let, kdy byl zkonstruován první spolehlivý konfokální mikroskop s rozmítaným laserovým paprskem.
Nikoli náhodou to bylo ve stejné době, kdy se staly běžně dostupnými výkonné minipočítače. Princip laserového rastrovacího konfokálního mikroskopu je znázorněn na obrázku. Pozorovaný vzorek je osvětlován bodovým zdrojem světla. Tím je laserový paprsek fokusovaný na clonku, která je pak objektivem mikroskopu zobrazena na vzorek, do bodu o průměru rovnajícím se rozlišovací schopnosti objektivu (tzv. difrakční mez). Tentýž objektiv pak sbírá světlo vzorkem odražené nebo rozptýlené, popřípadě jeho fluorescenci. Po zpětném průchodu tohoto sekundárního záření objektivem vznikne další obraz bodové clonky, který je pomocí děliče paprsků lokalizován před fotonásobič. Zde se nachází druhá, konfokální bodová clonka, blokující detekci záření pocházejícího z míst vzorku mimo rovinu, do které je mikroskop právě zaostřen. Obraz celé zaostřené roviny pak získáme jejím rastrováním bod po bodu, způsobem, který je v zásadě podobný tomu, jakým svazek elektronů vytváří obraz na televizní obrazovce.
Existují tři základní metody rastrování: cestou rozmítání laserového paprsku, příčným posouváním vzorku před objektivem, popřípadě posouváním objektivu nad vzorkem. Při rastrování je měřená intenzita světla registrována počítačem spolu s informací o souřadnicích analyzovaného bodu. Díky prostorové filtraci záření dopadajícího na detektor neobsahuje obraz vytvořený počítačem neostré pozadí pocházející z mimofokálních oblastí vzorku. V tomto smyslu jsou konfokální obrazy vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem. S objektivem o numerické apertuře ~ 1,3 a při použití modrozelené čáry argonového laseru (λ = 488 nm) činí tloušťka optických řezů asi 0,4 μm. Prostým vertikálním posouváním vzorku vůči objektivu je navíc umožněno pozorovat optické řezy v různých hloubkách pod povrchem.
Rozdíl mezi obyčejnou a konfokální fluorescenční mikroskopií demonstruje obr. Potlačení mlhavého pozadí obrazu a optická tomografie (zobrazování rovinných řezů vzorkem) nejsou jediným přínosem konfokálního zobrazování. Teoretická rozlišovací schopnost konfokálního mikroskopu se totiž nezakládá na Rayleighově kritériu, jelikož konfokální obraz objektu vzniká postupným skládáním z jednotlivých bodů, které jsou navíc pozorovány přes clonku, jejíž rozměry bývají menší než průměr Airyho kroužků.
Potíže plynoucí z metody sériového snímání obrazových bodů mohou být vyřešeny pokročilými technikami, jako je současné snímání fluoroforů pomocí více fotonásobičů a spektrálních filtrů pro více barev. Každé měření intenzity světla je zatíženo statistickým šumem, jehož velikost je úměrná √N/N, kde N je počet detegovaných fotonů. Je proto zřejmé, že čím slabší je detegované světelné záření, tím horší bude relativní přesnost stanovení intenzity v sousedních bodech, tj. obrazový šum.
Běžná doba snímání jednoho optického řezu s rozlišením 512 × 512 bodů o 256 úrovních jasu se pohybuje od 0,5 do desítek sekund. Počítačové zpracování obrazů a prostorová rekonstrukce objektů umožňuje konfokální obrazy optických řezů dále upravovat a provádět prostorovou rekonstrukci mikroskopických objektů.
Konfokální obrazy optických řezů vznikají v číselné formě a lze je dále upravovat všemi běžnými způsoby počítačového zpracování obrazů. Specialitou konfokální mikroskopie je možnost prostorové rekonstrukce mikroskopických objektů, opírající se o několik desítek až stovek optických řezů jedním objektem, postupně snímaných při plynule se měnící hloubce zaostření. Ze souboru optických řezů lze mimo jiné generovat stereoskopické páry - zvětšené obrazy celého trojrozměrného objektu viděné pravým a levým okem.
Stereoskopické páry skýtají velmi působivé plastické obrazy preparátů. Ze souboru horizontálních řezů lze také rekonstruovat vertikální optické řezy vzorkem. Vertikální řezy se ovšem dají získat i přímým způsobem, vhodnou volbou rastrovacího algoritmu mikroskopu. Další, poměrně nová metoda konfokální mikroskopie spočívá v současném snímání fluorescenčních obrazů pomocí tří fotonásobičů se spektrálními filtry pro modrou, zelenou a červenou barvu.
Aplikace konfokální mikroskopie. Unikátní schopnosti konfokálního mikroskopu zobrazovat preparáty s trojrozměrným rozlišením se využívá při studiu povrchových vlastností materiálů. V reflexním modu zobrazování se zkoumá textura a složení povrchů i eroze materiálů. Konfokálním mikroskopem se vyhodnocují výsledky mikrotestů tvrdosti kovů i plastických materiálů, měří se výška strukturních elementů na polovodičových čipech. Biologie a lékařský výzkum těží ze skutečnosti, že konfokální mikroskopie je ve své podstatě neinvazivním a nedestruktivním způsobem studia prostorové struktury buněk a tkání. Příkladem, kdy konfokální mikroskopie bezesporu převyšuje možnosti metod klasické mikroskopie, může být studium složité architektury neuronových sítí v mozkové tkáni. Konfokálním mikroskopem lze pomocí speciálních fluorescenčních sond studovat intracelulární koncentrace iontů, měřit membránový potenciál nebo vnitrobuněčné pH. Imunofluorescenčními metodami lze studovat rozložení receptorů v membránách, organizaci cytoskeletu, mitotický aparát během dělení, či struktura endoplazmatického retikula.
V uplynulých dvaceti letech zaznamenala optická mikroskopie pozoruhodný rozmach díky pokročilým objektivům, vyspělému zpracování obrazů a kombinaci s mikropočítači a laserovými zdroji světla. Technický pokrok pozměnil optickou mikroskopii do té míry, že je patrná jistá renesance jejího užití v buněčné biologii, kde dříve dominovala elektronová mikroskopie. Optický mikroskop se skládá z objektivu vytvářejícího zvětšený obraz a okuláru, zdroje světla a kondenzoru. Světlo interaguje s objektem různými způsoby - absorbce, lomení, odraz, rozptyl, změna fáze a případná fluorescence. Skutečnou roli určitého optického jevu určuje volba mikroskopické techniky.
- Rozlišení mikroskopu a Rayleighovo kritérium pro klasické zobrazování s Airyho kroužky.
- Konfokální obraz vznikající postupným skládáním bodů a potlačení zazáření mimo rovinu pomocí konfokální clony.
- Růst významu konfokálního zobrazování díky schopnosti pracovat v hlubších vrstvách vzorku a dosahovat 3D rekonstrukcí.
Teoreticky mohou konfokální mikroskopy využívat vyspělé detektory a vícekanálové systémy pro zpracování signálu v reálném čase a pro klinické aplikace CLE (confocal laser endomicroscopy). V rámci diferenciální diagnostiky je CLE relativně novou modalitou umožňující mikroskopické zobrazení vyšetřované tkáně v reálném čase, a tím neinvazivní in vivo biopsie. První zkušenosti s CLE byly získány především na poli endoskopickém, a to v oblasti patologie jícnu, žaludku, žlučových cest, pankreatu a tlustého střeva. V posledních letech se rozvíjí neendoskopické peroperační použití, zejména v neurochirurgii, chirurgii mamární a chirurgii prostaty.
V rámci prospektivních studií byl potvrzen přínos CLE při sledování premalignit, v diferenciální diagnostice nádorových či zánětlivých onemocnění a ve zrychlení diagnostiky. Použití CLE je zatíženo minimálním množstvím potenciálních nežádoucích účinků; rizikem je možná alergie na fluorescein. Prodloužení endoskopického vyšetření či operace vyžaduje pouze kvalifikovaný personál. Limitujícími faktory CLE jsou dosud nedostatečné klinické zkušenosti, cena přístroje a sond, subjektivní složka hodnocení mikroskopického obrazu a potřeba specializovaného školení personálu.
V uplynulých dvaceti letech došlo k pozoruhodnému rozmachu optické mikroskopie díky novým objektivům, videotechnice a zpracování obrazů. Díky tomu se konfokální zobrazování stává běžnou součástí moderního biologického a lékařského výzkumu a rozšiřuje možnosti studia struktur buněk i tkání v trojrozměrném rozsahu.
Konfokalni mikroskop
tags: #tlostka #z #scan #konfokalni