Vyšetření konfokálním mikroskopem: principy, výhody a aplikace

Obecný optický mikroskop se skládá ze tří částí: osvětlovací systém včetně světelného zdroje a kondenzoru; optický zesilovací systém složený z objektivu a okuláru; a systém pro získání a zpracování obrazu. Rozlišení mikroskopu závisí na vlnové délce světla, aperturním poměru a indexu lomu prostředí a určuje schopnost rozlišit malý interval objektu. Konfokální mikroskop uvádí do popředí inovaci, která umožňuje získat živý obraz s trojrozměrnými informacemi změnou ohniskové roviny a následnou rekonstrukcí obrazu v obrazové paměti.

Proč používat konfokální mikroskop

Laserový skenovací konfokální mikroskop využívá optický systém, který extrahuje obrazovou informaci v rovině soustředného ohniska a obnovuje získané informace v obrazové paměti při změně ohniska, což umožňuje získat trojrozměrný obraz povrchových tvarů vzorku, který není potvrditelný u běžných mikroskopů. Výhody konfokálního systému spočívají v tom, že osvětluje jen bod vzorku a odražené světlo je přijímáno bodovými receptory; při správném zaostření je téměř všechno odražené světlo schopno dosáhnout fotoreceptoru, zatímco mimo ohnisko je zobrazení potlačeno.

V konfokálním systému je zdroj světla obvykle laser, který je velmi bodový. Laserové zdroje umožňují vysokou koncentrovanost energie a lepší kontrast obrazu. Při vysokorychlostním skenování lze pozorovat v reálném čase díky AO deflektoru a Servo Galvano-mirroru, které zajišťují horizontální a vertikální pohyb skenovacího laseru bez mechanických vibrací.

Citlivá selektivita ohniskové roviny a vysoký kontrast vyplývají z redukce rozptýleného světla mimo ohnisko a z potlačení světla uvnitř čočky, což umožňuje detailní zobrazení i u vzorků vyšší tloušťky a s lepším poměrem signálu k šumu. Funkce optické lokalizace potlačuje světlo z oblastí mimo ohniskovou rovinu a vytváří tak obraz připomínající průřez vzorkem s jasně definovanými vrstvami.

Princip činnosti konfokálního mikroskopu

Princip spočívá v tom, že vzorek je osvětlen bodovým zdrojem světla; laserový paprsek je fokusován na clonku, která je pak zobrazena objektivem na vzorek do bodu o průměru odpovídajícím rozlišovací schopnosti objektivu (difrakční mez). Stejný objektiv sbírá světlo odražené nebo emitované fluorescencí a prochází zpět k fotonásobiči, kde je lokalizováno konfokálními clonami. Obraz celé zaostřené roviny získáme rastrováním bod po bodu, což umožňuje potlačení mimofokálního pozadí a vznik optických řezů.

Při rastrování existují tři základní metody: rozmítání laserového paprsku, příčné posouvání vzorku a posouvání objektivu nad vzorkem. Rozlišení konfokálního mikroskopu je často menší než průměr Airyho kroužků a neomezuje jej jen Rayleighův kritérium; obraz vzniká skládáním jednotlivých bodů přes clonku.

Specifika rozlišení a obrazových řezů

Teoretická rozlišovací schopnost konfokálního mikroskopu se liší od tradiční fibroskopie tím, že zohledňuje skládání obrazových bodů přes malou konfokální clonu. Při modrém světle má theoretically nejvyšší rozlišení kolem 0,17 μm. Tloušťka optických řezů u konfokálního mikroskopu s číslem NA kolem 1,3 a argonovým laserem na 488 nm bývá přibližně 0,4 μm. Vertikálním posouváním vzorku lze pozorovat řez v různých hloubkách pod povrchem.

Pomocí počítačového zpracování a prostorové rekonstrukce lze z řezů vytvořit trojrozměrný model vzorku; lze generovat stereoskopické páry a rekonstruovat vertikální řezy z horizontálních řezů. Nové metody zahrnují simultánní snímání více barvami (modrá, zelená, červená) pomocí tří fotonásobičů a filtrů.

Aplikace konfokální mikroskopie

V materiálové vědě se konfokální mikroskopie využívá k studiu povrchových vlastností, textury a eroze, k vyhodnocování mikrotestů tvrdosti kovů a plastických materiálů, a k měření výšky struktur na polovodičových čipech. V biologii a lékařském výzkumu umožňuje neinvazivní a nedestruktivní studium prostorové struktury buněk a tkání, zjišťování intracelulárních koncentrací iontů (K+, Ca2+), měření membránového potenciálu a vnitrobuněčného pH. Imunofluorescenční metody pak sledují rozložení receptorů v membránách, organizaci cytoskeletu a další buněčné struktury.

V klinické praxi se konfokální mikroskopií zkoumá rohovka in vivo; umožňuje zobrazit jednotlivé vrstvy rohovky ve frontální rovině a je používána pro diagnostiku různých rohovkových onemocnění, degenerací a infekčních onemocnění. V současnosti se konfokální mikroskop používá i pro časnou diagnostiku neuropatie u pacientů s cukrovkou a pro plánování operací konservativních i chirurgických zákroků v oftalmologii. Buftalmus u dětí je stav vyvolaný vysokým nitroočním tlakem, a konfokální mikroskopie přináší detailní pohled na rohovkové vrstvy a pomáhá porozumět změnám v endoteli a bazálním epitelu, které souvisejí s léčbou a terapií glaukomu.

Historie a technický vývoj

Idea konfokálního mikroskopu pochází od Mare Minskyho, který ji patentoval v roce 1957, avšak dříve byl nedostatek vhodného zdroje světla. Později, kolem roku 1967, Petráň a Hadravský z Plzně patentovali konfokální mikroskop na bázi Nipkowova kotouče, známý jako Tandem Scanning Confocal Microscope, jehož praktické rozšíření bylo omezené. Era konfokální mikroskopie skutečně začala koncem 70. let s konstrukcí prvního spolehlivého konfokálního mikroskopu s laserským rastrováním a výkonnými mikropočítači. Technický pokrok - vyspělé objektivy, videotechnika a laserové zdroje - radikálně změnil optickou mikroskopii a umožnil její široké využití v buněčné biologii a dalších oborech.

Konfokální mikroskop je dnes standardním nástrojem pro studium trojrozměrné architektury buněk a tkání, s aplikacemi od výše zmíněných rohovkových vyšetření až po výzkum neuronových sítí a intracelulárních procesů z moderních fluorescenčních sond.

Význam konfokální mikroskopie spočívá v možnosti získat ostrý obraz z jedné ohniskové roviny a poté složit obraz z více rovin k celkové trojrozměrné rekonstrukci. Nicméně nevýhodou zůstává koncentrace vysokého laserového paprsku na jednotlivé body a tím potenciální fototoxicita vzorku při dlouhém pozorování a omezené rychlosti při vysokém rozlišení. Srovnání s widefield mikroskopií ukazuje, že konfokální obraz odstraňuje pozadí z oblastí mimo ohniskovou rovinu, což výrazně zvyšuje kontrast a detailnost.

Pro metody zpracování obrazů a vizualizace je konfokální systém často doplněn softwarem (např. Imaris) pro 3D vizualizace a digitální rekonstrukce trojrozměrných struktur.

1. Laserový zdroj a konfokální clony zajišťují bodové osvětlení a selektivní detekci.
2. Rovinné optické řezy vznikají postupným skenováním a silným potlačením signálu mimo rovinu.
3. Konfokální mikroskopie umožňuje studovat trojrozměrnou strukturu vzorků a přináší vysoký kontrast.

tags: #vysetreni #konfokalnim #mikroskopem