Optický (světelný) mikroskop je zařízení, které používáme k pozorování předmětů, které nejsme schopni spatřit pouhým okem, tj. předmětů, které mají velikost menší než 0,2 mm. Jeho rozlišovací schopnost (schopnost odlišit od sebe dva body) je tedy 0,2 μm. Pro menší předměty musíme použít mikroskop elektronový, který rozliší předměty až do velikosti 0,1 nm. Tedy předměty o tři řády menší, než zvládá rozlišit mikroskop světelný.
Již ve starověku byly používány různé čočky na pozorování předmětů, které byly příliš malé na pozorování pouhým okem. První velký objev se ovšem datuje do 17. století, kdy Anton van Leeuwenhoek vynalezl přístroj, který se skládal z šroubku, kovového plátku, drážky na upevnění předmětu a sférické čočky. Tento přístroj se dnešnímu mikroskopu nepodobal, je ovšem až obdivuhodné, že jím bylo možné dosáhnout neuvěřitelného zvětšení až 250-500x. K dalšímu přelomovému objevu dospěl Robert Hook, který jako první začal pracovat se světlem v mikroskopii.
Nejdůležitější částí optického mikroskopu je objektiv. Jedná se o soustavu obvykle několika čoček, které dohromady fungují jako spojná čočka. Předmět, který v mikroskopu pozorujeme, musí být umístěn ve vzdálenosti mezi f a 2f, tak bude obraz skutečný, zvětšený a převrácený. V praxi má objektiv malou ohniskovou vzdálenost (v řádu milimetrů), proto poskytuje větší zvětšení než okulár, jehož ohnisková vzdálenost se volí větší (v řádu centimetrů).
Objektiv určuje zvětšení a kvalitu výsledného obrazu (čím kvalitnější obraz požadujeme, tím kvalitnější objektiv musíme použít). Okulár, jak již název napovídá, je část mikroskopu, do které pozorovatel hledí. Podobně jako objektiv se skládá ze soustavy čoček, ale oproti objektivu jich má méně. Tyto čočky společně opět fungují jako spojná čočka a poskytují zdánlivý, zvětšený a přímý obraz. Kromě objektivu a okuláru nalezneme v mikroskopu ještě kondenzor, soustavu čoček nebo zrcadel, které soustřeďují paprsky na pozorovaný objekt a zajišťují osvětlení.
Běžný mikroskop sestává jednak z optické soustavy, ve které vzniká obraz, a jednak z mechanické části. Tu tvoří stativ a stolek, na který se umístí preparát a pomocí makro-šroubu zkoumaný objekt posouváme do vzdálenosti f - 2f objektivu, kde se preparát začne zaostřovat. K jemnému doostření slouží mikro-šroub, který se nachází těsně u makro-šroubu. Zobrazovacích metod ve světelné mikroskopii je spousta. Preparáty jsou obvykle naneseny na průhledném sklíčku, které je prosvětlováno konkrétním světlem, a my potom můžeme vidět dané preparáty v okuláru. Metoda světelného pole je metoda, kdy dochází k prosvícení preparátu, a my ho vnímáme jako objekt s tmavými obrysy, který se vyskytuje ve světlém poli. Může docházet i k odražení paprsků, které pak vstupují do objektivu. Metoda temného pole je svým způsobem opakem výše uvedené metody a předmět pozorujeme jako světlý předmět ve tmavém poli. Důvod tmavého podkladu je ten, že paprsky, které preparát osvětlují, nevstupují do objektivu. Další metodou, která je velmi používaná, zvláště v pozorování biologických preparátů, je metoda fázového kontrastu. Struktury, které chceme v preparátu pozorovat, se zpravidla liší svým indexem lomu od okolí. Poté, co světlo projde skrz objektiv a následně okulár, dostáváme zdánlivý, zvětšený a převrácený obraz. Maximální zvětšení optického mikroskopu ovšem nemůže přesáhnout 2000.
Tímto termínem se rozumí schopnost objektivu zachytit co nejširší úhel paprsků. Je to schopnost mikroskopu odlišit od sebe 2 body. Závisí na vlnové délce použitého světla, indexu lomu prostředí a samozřejmě na vlastnostech objektivu. Práce s mikroskopem, mikroskopické preparáty.
Bakterie se vyskytují ve společenstvech tvořených mnoha druhy s obrovskou početností. Při studiu konkrétního typu bakterií je nezbytné vytvořit kolonii bakterií pocházejících z jedné jediné buňky. Taková populace jedinců vzniklých vegetativním rozmnožením se v mikrobiologii nazývá čistá kultura. Izolaci a kultivaci bakterií poprvé použil Robert Koch. Koch získal čistou kulturu tak, že jako živné médium použil zpevněné substráty typu agar. Existuje celá škála živných půd pro mikroorganismy, které musí mít obecné vlastnosti včetně zdroje energie, uhlíku, dusíku a dalších prvků; zajišťují průchod dýchacích plynů a zároveň zabraňují průniku bakterií z okolí.
Sterilizace je proces zahubění všeho živého v daném prostředí. Systém musí být při sterilizaci uzavřen tak, aby po skončení nedošlo k nové kontaminaci. Sterilizaci lze provádět několika způsoby: žíháním, suchým teplem, vodní parou. Při přípravě živných půd se vyžaduje sterilní prostředí a důsledná aseptická práce. Příprava živného agaru vyžaduje míchání složek (masopeptonový bujón, agarová půda) a sterilizaci v tlakovém hrnci. Po nalití do Petriho misek necháme agary ztuhnout a poté očkujeme vzorky pro kultivaci bakterií. Po naočkování do živného média se bakterie pomnoží zpravidla za 3-5 dní.
Barvení bakterií se používá, protože bakterie často nejsou v optickém mikroskopu dobře viditelné. Každé organické barvivo se skládá ze dvou částí: chromoforu a auxochromu. Chromofor uděluje barevnost, auxochrom zajišťuje vazbu barviva na buňku. Gramovo barvení je diferenciální barvení, které umožňuje rozlišit typy bakterií na základě jejich buněčné stěny. Objektiv vytváří převrácený a zvětšený obraz; ohnisková vzdálenost se pohybuje v řádu milimetrů a numerická apertura objektivu je uvedena na plášti objektivu. Hloubka ostrosti je nepřímo úměrná numerické apertura. Okulár dále zvětšuje obraz podle konstrukce, typicky 5x až 20x. Celkové zvětšení mikroskopu je součinem zvětšení objektivu a okuláru.
Bakterie se dobře pozorují pomocí mikroskopu s fázovým kontrastem. Očkování je přenesení části populace čisté kultury do jiné nádoby s živným médiem. Mikrobiologická klička umožňuje připravit tenký film z bakteriální biomasy na sklo, který po zaschnutí fixujeme protažením plamenem a barvíme. Po barvení se preparát promývá a pozoruje v olejové imerzi. Pro počítání bakterií se kultury ředí a počítají kolonie po inkubaci. Po ředění se kultivační materiál nanáší na několik Petriho misek a výsledky se hodnotí po uplynutí 24-48 hodin.
Mezi známé bakterie a související témata patří Escherichia coli jako indikátor fekálního znečištění, Lactobacillus jako součást mikroflóry a potravinářská využití, Streptococcus a Staphylococcus aureus jako patogeny, či bakterie spojené s límencem a spirochéty. Důležitá je také poznámka, že mikroskopie je technika k pozorování objektů tak malých, že nejsou viditelné pouhým okem; elektronová mikroskopie nabízí vyšší rozlišení a zvětšení, avšak optické mikroskopy zůstávají nezbytné pro běžnou laborní práci a vzdělávání.
Pokud řešíte jen základní úkoly tohoto tématu, lze v krajním případě od sterilizace upustit, avšak s uvážením, že některé vzorky mohou být znehodnoceny bakteriálním plakem. V praxi se pro mikroskopii a mikrobiologii využívá řada kultur a půd, z nichž masopeptonový bujón a masopeptonový agar patří mezi klasické živné půdy pro bakterie. Obrázky a popisy připravených preparátů, filtrů a postupů v textech doplňují ilustrace postupů a schématický obraz technik.
Obrázky a videa k tématu mohou doplnit text:
Mikroskopy a jak používat světelný mikroskop
Masopeptonový bujon a agar slouží jako základní živné půdy pro kultivaci bakterií; postupy sterilizace zahrnují žíhání, suché teplo a parou. Zónování a očkování zkušebních ploch na Agaru se provádí opatrně za aseptických podmínek a pomocí sterilního náčiní.
Maximální zvětšení optického mikroskopu bývá kolem 2000x; pro pozorování bakterií je často nutné 1200x a vyšší zvětšení spolu s vhodnou barvou vzorku. Dlouhé texty o optických soustavách objasní, proč je klíčové vyvážení ostrosti, kontrastu a rozlišení v praktickém použití.
tags: #bakterie #v #optickem #mikroskopu