Většina světelných mikroskopů umožňuje pozorování objektů, které výrazně pohlcují procházející světlo a mění amplitudu elektromagnetického vlnění. Existuje však řada objektů, které po průchodu světla neposkytují velké rozdíly v absorpci, a tedy bývají pro pozorování v procházejícím světle nevhodné. Tyto objekty mění jen fázi procházejícího světelného vlnění v důsledku různých indexů lomu v různých bodech vzorku. Paprsky procházející preparátem se tedy liší fází světelné vlny, a malé fázové rozdíly bývají pro lidské oko neviditelné.
Aby bylo možné fázové rozdíly zobrazit, byl vyvinut tzv. fázový mikroskop, který dokáže převést fázové změny na amplitudové změny, tedy na vnímatelný jas a kontrast. Obraz vzniká interferencí dvou vlnění: přímého, které prochází vzorkem beze změny, a difrakčního, které je posunuto kvůli fázovému objektu. Dvě hlavní optické dráhy se oddělují pomocí fázové destičky ve tvaru prstence, umístěné v obrazovém ohnisku objektivu.
Princip fázového kontrastu
Existují dvě formy fázového kontrastu: pozitivní a negativní. U pozitivního fázového kontrastu posouvá fázová destička o optické tloušťce 3/4 vlnové délky fázi přímého vlnění o +90°. U negativního fázového kontrastu posouvá destička o 1/4 vlnové délky fázi o -90°. Tyto posuny umožňují, aby rozdíly ve fázi vzorku byly převedeny na změny amplitudy a tedy na jas v obrazové rovině. Mikroskopie fázového kontrastu je zvláště užitečná pro nezabarvené objekty, především struktury v živých buňkách, jako jsou jádro, jadérko, chromozómy a vakuoly.
Podstatou je transformace fázových rozdílů na amplitudový signál, protože lidské oko rozlišuje změny intenzity světla. Délka optické dráhy, která souvisí s indexem lomu a tloušťkou vzorku, určuje fázový posun. Interference různých vln doprovází tvorbu obrazového kontrastu, přičemž klíčovými prvky mikroskopu s fázovým kontrastem jsou otvor mezikruží a fázová destička.
V Köhlerově osvětlení jsou světelné vlny, které neinteragují se vzorkem, zaostřeny jako jasný prstenec v zadní ohniskové rovině. Část světla, která prošla vzorkem bez difrakce, prochází fázovým prstencem a je ovlivněna rotací fáze o λ/4, zatímco difrakčně rozptýlené světlo bývá zpomaleno o tuto fázi. Celkový fázový posun mezi světlem lomeným vzorkem a světlem procházejícím fázovým prstencem je až λ/2, což vede k destruktivní interferenci v obrazové rovině.
Fázový prstenec je centrální součástí; je to šedý filtr a zádržná deska, která tlumí přímé světlo a umožňuje průchod světla rozptýleného vzorkem. Struktury vzorku, jako plazmatické membrány a organely, ovlivňují délku optické dráhy a tím i obrazový kontrast. Halo efekt a stínový efekt popisují charakteristiky obrazu kolem velkých objektů či homogenních částí vzorku, které dále ovlivňují interpretaci kontrastu.
Historie a praktické aspekty
Princip fázového kontrastu popsal Frits Zernike; za tento objev byla mu udělena Nobelova cena. Technika využívá rozdíly v délce optické dráhy k zviditelnění neobarvených fázových objektů, zejména plochých buněk. Fázový kontrast umožňuje pozorovat struktury živých buněk bez barvení, čímž se minimalizuje potenciální toxicita běžných barviv.
Existují dva hlavní typy fázového kontrastu a jejich rozdílem je fázová destička používaná pro osvětlení. U pozitivního fázového kontrastu objekty s vyšším indexem lomu než je médium se zobrazují tmavěji než objekty s nižším indexem lomu. Halo efekt kolem velkých objektů je způsoben tím, že část difrakčně rozptýleného světla prochází fázovým prstencem, a tak se jejich fáze udržuje v určitém posunu. Inverze kontrastu může nastat, pokud jsou vedle sebe objekty s vysokým i nízkým indexem lomu, což může ztížit interpretaci, ale technika zůstává pohodlnou a důležitou pro zobrazování fázových objektů.
Konsteluace a praktické varianty použití
NEXCOPE NIB630 a NEXCOPE NIB620 představují moderní pracovní pomůcky pro mikroskopii s fázovým kontrastem a pro práci s kamerami: trinokulární tubus pro montáž digitální kamery, boční port pro kameru, a možnost připojení k digitálnímu monitoru. Přizpůsobení jasu a automatické úpravy při změně objektivu zajišťuje koherentní vizualizaci. Kondenzor s fázovým kontrastem umožňuje snadné přepínání mezi technikami a 30 W halogenové osvětlení s nastavitelným jasem podporuje komfortní práci.
Pro studium průhledných vzorků, převážně živých buněk, bez barvení, bývá použita 4×, 10× a 20× zvětšení, případně olejového imerzního objektivu 100×/1,25 s rovněž fázovým kontrastem v některých konfiguracích. Mikrospoik pracovní stanice MAGUS Bio VD350 se používá pro obarvené i neobarvené vzorky v různých nádobách. Přestože text zmíní některé praktické detaily o výšce misek či tloušťkách dna, hlavní význam spočívá v tom, že fázový mikroskop umožňuje pracovat s živými vzorky bez škodlivého barvení.
Pro zajištění kvalitního obrazu bývá používán trinokulární systém s volitelným otočením hlavice o 180° a možností nastavení výšky výstupní pupily. Integrovaný displej a duální ostření usnadňují manipulaci a umožňují použití mikroskopu i s nasazenými brýlemi. Zdrojem světla bývá halogenová lampička a záznam obrazu se realizuje prostřednictvím kompatibilních kamer a monitorů s vysokým rozlišením až 3840×2160 px a rychlostí až 45 fps (v plném rozlišení).
V sestavě bývají realisticky uvedené části, jako adaptéry pro zvětšení, držáky stolu a čtyři filtry pro barevné korekce. Kondenzor s fázovým kontrastem umožňuje snadné a pohodlné přepínání mezi mikroskopickými technikami. Ruční i jemné ostření poskytuje přesnou manipulaci nad vzorkem, zatímco konstrukční prvky zajišťují stabilitu a ochranu vzorku při manipulaci.
Specifikace a aplikace v praxi
Fázový kontrast je zvláště užitečný pro obrazovou mapu optické hustoty vzorku, kde optická hustota zásadně ovlivňuje index lomu vzorku. Halo a stínový efekt bývají součástí obrazu a je třeba je brát v potaz při interpretaci. Při použití fázového kontrastu lze promítnout obraz bez potřeby barvení, což je zvláště výhodné pro živé buňky.
V závěru lze říci, že mikroskopie s fázovým kontrastem nabízí pohodlné a důležité řešení pro zviditelnění fázových objektů v procházejícím světle. Objektivy, kondenzory a fázové destičky spolupracují na vytvoření kontrastu, který umožňuje pozorování struktur, které by jinak zůstaly beze změny ve fázi a bez viditelného jasu.
