Vyšetření krve v temném poli je metoda, která poslední dobou nabývá na stále větší popularitě. Pozorování v temném poli je speciální metoda mikroskopického pozorování, která umožňuje pozorovat detaily, které jsou při běžném pozorování (tzv. ve světlém poli) neviditelné. Její podstatou je, že světlo, na rozdíl od pozorování ve světlém poli, neprochází kondenzorem přímo, tedy v optické ose, ale šikmo, pod určitým úhlem, a také pouze po okrajích. Výsledkem je, že krvinky nevidíme červené na světlém pozadí jako ve světlém poli, ale pozadí je tmavé, plocha krvinek je také poměrně tmavá, i když podstatně světlejší, než pozadí, a okraje krvinek barevně svítí.
Trinokulární laboratorní mikroskop v sestavě s kondenzorem temného pole a digitální kamerou speciálně určené pro pozorování metodou darkfield a pořizování obrazového záznamu. Optika nové generace poskytuje brilantní obraz. Nekonečná optika nové generace poskytuje brilantní obraz jemně prokreslený ve středu i u okraje zorného pole. Temné pole je řešeno pomocí posuvné destičky pro velmi pohodlné přepínání mezi pozorováním ve světlém a temném poli. Výkonné planachromatické objektivy poskytují obraz s vysokým rozlišením, kontrastem a perfektní ostrostí. Digitální kamera s rozlišením 3,0MPix. Stále z toho nejste moudří a nedokážete se rozhodnout, který darkfield mikroskop by byl pro Vás a Vaše pozorování nejlepší?
19. 05. 2021Hranice jsou prolomeny. Sledovat mikroskopem procesy na molekulární úrovni bylo ještě donedávna nemožné - v buňkách se vše odehrává ve zlomku sekundy a jednotliví účastníci této podívané jsou tak drobní, že zatím vzdorovali zrakům zvědavců. Vědci z Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR však nyní učinili první kroky k odhalení jevů hluboko pod povrchem. Objevili novou technologii optické mikroskopie, díky níž zrekonstruovali dokonce trojrozměrný rozpohybovaný obraz ze života jedné molekuly. Také se někdy zadíváte třeba na vlastní ruku a říkáte si, kolik asi procesů se v ní každou sekundu odehrává? Aby prsty mohly uchopit propisku a psát, aby se odřenina po pádu z kola nebo spálenina od hrnce zacelily a po několika dnech po nich nebyla ani veta.
Věda už spoustu pochodů lidského či obecně živočišného těla nebo rostlin zná, dokáže je popsat a vysvětlit. Ne vždy ale umí vše i pozorovat. Přitom vidět na vlastní oči znamená posouvat hranice poznání. Vidět více a v jemnějších detailech - to je cíl nanooptiky, oboru, který se ujímá žezla tam, kde klasická mikroskopie naráží na své limity. Už před více než sto lety německý fyzik Ernst Abbe popsal, že ani ten nejlepší optický mikroskop nedokáže rozlišit struktury menší než zhruba polovina vlnové délky světla, tedy asi 200 nanometrů. Až přelom milénia přinesl průlom zdánlivě nepřekročitelného difrakčního limitu.
Tým vědců z Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR zná metody a postupy, jak se dívat nejen do nitra buněk, ale ještě dál - do nitra jejich stavebních kamenů - a současně sledovat procesy látkové přeměny, chování a život buněk. „Dokážeme zrekonstruovat dynamiku uvnitř molekul v buňce, výsledkem je živý hologram. Jinými slovy umíme trasovat polohu nanočástice, která se pohybuje v malé struktuře, a to ve třech rozměrech a každou milisekundu.“ Ve spolupráci s kolegy z Biotechnologického ústavu AV ČR fyzici popsali činnost důležitého proteinu podílejícího se na dělení buněk. Do středu jejich zájmu se dostaly mikrotubuly a jejich interakce s proteinem Ase1. „Na povrch mikrotubulu se váže zmíněný protein, ne ovšem napevno, ale tak, že se může pohybovat, klouže po něm, slouží jako ložisko,“ vysvětluje Marek Piliarik. „Proplétá tak mikrotubuly mezi sebou. Podařilo se to až nyní díky prostorovému modulátoru světla za pomoci velmi rychlých změn teploty. Součástí zařízení je laserem zahřívaný čip, v němž se vytvoří gradientní čočka. „Je to podobný jev jako fata morgána nad silnicí - jakmile se zahřívá vzduch, dochází k jinému indexu zlomu a začne odrážet světlo. Podobným efektem ovlivňujeme šíření světla v našem mikroskopu,“ přibližuje technickou stránku složitého přístroje fyzik.
Hra stínůA jak tedy hologram mikrotubulu a jeho souputníka proteinu vypadá? Vědci stále nemohou pozorovat molekuly v ostrých obrysech, vidí spíše jejich stín, hologram je v jednom směru difrakčně rozmazaný, ale v kolmém je možné určit jeho vzdálenost od povrchu s přesností na nanometry. Člověk typicky vidí šedou tečku, která mění svou polohu a kontrast. Prostorový modulátor umožní hbitě přeostřovat a každá tato změna přinese informaci o poloze a vlastnostech molekuly. „V zásadě nevidíme, jestli je molekula rovná, nebo zahnutá. To, co vidíme, lze připodobnit třeba ke kruhům ve vodě, když do ní hodíte kámen. Nezáleží, jestli byl placatý, nebo kulatý, vždy budou výsledkem kruhy,“ objasňuje Marek Piliarik.
Vědci nicméně podle polarizačních vlastností světla zaznamenají, pokud molekula tvar změní. Odborníci z oddělení nanooptiky v Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR a Biotechnologického ústavu AV ČR si letos připsali již druhý velký úspěch. Vedle článku o hologramu proteinu klouzajícího po mikrotubulu, jejž uveřejnil prestižní časopis Nature Communications, již v únoru vysvětlili dynamiku při rozpadu mikrotubulů. Jev známý dekády a zobrazovaný jako kudrlinky proteinů se díky vysokorychlostnímu snímání speciální rozptylovou mikroskopií podařilo popsat do dosud nepoznaných detailů.
Oba výsledky vědci chtějí dále rozvíjet, nové mikroskopické metody nabízejí mnohá využití, především ve vědeckém prostředí, kde na objevení čeká nespočet fenoménů, které zatím nebylo možné doložit nebo popsat bez vhodné zobrazovací technologie. Uplatnění by však mohly najít i v komerčním světě, například spotřební elektronice. „Prostorové modulátory jsou technika, která je docela dobře zmapována, používá se mimo jiné v projektorech. Tam jsou podobné čipy na bázi tekutých krystalů, které jsou ale stokrát pomalejší než ty, jež jsme vyvinuli my.
Metody mikroskopického zobrazování zdokonalují i vědci v Ústavu molekulární genetiky AV ČR. Prostřednictvím kryoelektronové mikroskopie se jim podařilo zobrazit buněčné struktury v téměř atomárním rozlišení. Jak malé objekty je možné ještě vidět? Lupu. o vlnové délce srovnatelné s velikostí objektu. Budeme pozorovat rozmazaně. A hybnost a pozorovaný objekt značně naruší nebo dokonce odrazí z místa pozorování. V optickém oboru za pomoci soustavy čoček. Využívá vlnových vlastností elektronu. Menší předměty než za pomoci světla. Mikroskopie pro procházející světlo je založena na tzv. diaskopickém osvětlení, což znamená, že pozorovaný objekt je umístěn mezi světelný zdroj a objektiv.
Osvětlení je zajišťováno bílým světlem, kužel paprsků prochází vzorkem a vstupuje do objektivu. Jeho nevýhodou je nízký kontrast při pozorování většiny biologických vzorků (protože jen málo z nich výrazněji absorbuje světlo), a proto je často nutné použití různých barvících technik. Hoffmanův modulační kontrast je rozšířenou metodou používanou např. Při pozorování v temném poli nedopadá světlo procházející rovinou vzorku přímo do objektivu, a proto je zorné pole tmavé. Toho lze docílit zastíněním výstupní čočky kondenzoru clonou pro tmavé pole (popřípadě volbou speciálního kondenzoru určeného pro tento druh pozorování), která odstíní centrální část světelného kužele a ponechá jen vnější prstenec paprsků. Největší nevýhoda této techniky tkví v tom, že pro tvorbu obrazu je využita jen malá část světelné intenzity zdroje, který proto musí mít dostatečně vysoký výkon. Rheinbergovo osvětlení je zvláštní metodou pozorování v tmavém poli. Před kondenzor se vloží průhledný barevný filtr složený ze dvou částí odlišné barvy − centrálního terčíku a vnějšího prstence.
Některé typy preparátů je možné (například krevní nátěr) či dokonce nutné pozorovat bez krycího skla. Preparáty se pozorují ve světlých mikroskopech (žákovské, studentské, biologické, laboratorní, badatelské mikroskopy) a ve speciálních mikroskopech (např. krycí sklo je základní potřebou při přípravě mikroskopických preparátů). Uzavírá vzorek rostlinné či živočišné tkáně, umístěný ve speciálním médiu na podložním skle. Podložní sklo je základní potřebou pro přípravu mikroskopických preparátů. Standardní rozměr je 76 x 26 mm s tloušťkou 1,2 mm. Je speciální mikroskop, určený pro pozorování trojrozměrných neprůhledných předmětů. Tento typ mikroskopů je vybaven nižším zvětšením (obvykle 20 - 50x nebo 100x) než běžné světelné mikroskopy a vrchním osvětlením. Je souhrnné označení pro osvětlení, která na výstupu produkují pouze světlo, nikoliv teplo.
Jakýkoliv předmět, který je možné pozorovat přímo a není nutné jej upravovat do podoby mikroskopického preparátu, např. květ, list, minerál, hmyz, mince, atd., lze pozorovat s pomocí různých technik světelné mikroskopie. Slouží k eliminaci nežádoucích odlesků (prasátek) při pozorování výrazně lesklých předmětů, např. z vybroušeného kovu, broušených minerálů, lesklých krovek brouků, umělých střev, atd. Otáčením dvojice filtrů dospějeme do polohy, kdy jsou odlesky eliminovány. Polarizované světlo a polarizační filtry umožňují pozorovat preparáty v polarizovaném světle a zvyšovat kontrast tkání.
fázově kontrastní a tmavofólní mikroskopy
Podstatné pojmy a komponenty temného pole zahrnují: diaskopické osvětlení, kondenzor pro tmavé pole, Rheinbergovo osvětlení a polarizační techniky. Osvětlení v temném poli využívá jen okrajů světelného kužele; centrální část je odstíněna clonou kondenzoru. Tím vzniká tmavé pozadí a světlé obrysy prchajících či kovových struktur. Výhodou temného pole je vysoký kontrast pro nepotlačené transparentní vzorky, jako jsou krevní nátěry, mikroorganismy a drobné struktury. Nevýhodou je nižší efektivita osvětlení a potřeba výkonného světla pro dostatečnou kvalitu obrazu. Moderní darkfield mikroskopy často integrují digitální kamery pro snadný záznam a analýzu dat.
Další souvislosti: nanooptika a 3D zobrazování molekul se projevují i ve velkých vědeckých projektech, kde je cílem popsat dynamiku uvnitř buněk a zobrazit molekulární procesy v čase. 3D rekonstrukce pohybů molekul, hologramy a rychlé režimy snímání rozšiřují možnosti výzkumu v biologii i materiálové vědě. Prostorové modulátory světla a gradientní čočky umožňují přesnější určení polohy molekul a jejich vlastností v prostoru.
| Technika | Charakteristika | Kontrast a využití |
|---|---|---|
| Temné pole | Osvětlení šikmé, tmavé pozadí, okraje svítí | Vysoký kontrast pro transparentní vzorky |
| Diaskopické osvětlení | Objekt mezi zdrojem a objektivem | Vyžaduje průhlednost preparátu |
| Rheinbergovo osvětlení | Barevný filtr s centrálním terčem | Speciální tmavé pole s barevným kontrastem |
| Polarizační kontrast | Polarizátor a analyzátor | Eliminuje odlesky, zvyšuje kontrast tkání |
Principy moderní mikroskopie zahrnují také jiné techniky, jako AFM (Atomic Force Microscope) a STM (Scanning Tunneling Microscope), které umožňují pozorování na atomární úrovni. AFM skenuje povrch pomocí hrotu a měří interakce s povrchem; STM využívá tunelovací jev a sleduje proud mezi hrotem a povrchem. Vývoj v těchto technikách vedl k největšímu rozlišení, až 77 pikometrů, a umožnil zobrazit jednotlivé atomy na povrchu. Tyto přístroje ukazují, jak se mikroskopie vyvíjí od klasického světelného pozorování k propojení s elektronovou a nano-úrovní zobrazovací technikou.