Další metodou je tzv. metoda temné pole [2,4,8,13]. Princip metody spočívá v tom, že předmět je osvětlen pomocí kondenzoru se clonou ve tvaru mezikruží (která se nachází v jeho předmětové ohniskové rovině) tak, že numerická apertura světelného svazku vystupujícího z kondenzoru je větší než numerická apertura mikroskopového objektivu použitého k pozorování daného předmětu (kondenzor je centrálně zacloněn). Do objektivu se tedy dostane jen to světlo, které je rozptýleno předmětem. Předmět se pak jeví jako svítící na tmavém pozadí a je dobře viditelný.
Biologický mikroskop využívá k pozorování procházející světlo. Byly však vyvinuty různé režimy pozorování pro použití specifických světelných charakteristik u konkrétních vzorků, jako jsou průhledné vzorky a vzorky, které nepropouštějí světlo. V níže uvedené tabulce jsou uvedeny vlastnosti hlavních režimů pozorování. Krystaly, např. Vzorek se obarví fluorescenční sloučeninou nebo fluorescenčním proteinem, např. Typ mikroskopie obecně využívaný u biologických mikroskopů. Celý vzorek se osvětlí přímým světlem a pozoruje se v procházejícím nebo odraženém světle. Tento typ mikroskopie umožňuje, aby se do čočky dostalo pouze světlo rozptýlené nebo difraktované vzorkem, takže světlo může být promítáno proti tmavému zornému poli. Je vhodný pro pozorování bezbarvých, průhledných vzorků, např. živých buněk, které je obtížné identifikovat mikroskopií ve světelném poli. Mikroskopie v temném poli také umožňuje pozorování nepatrných prvků nad limitem rozlišení optických mikroskopů. Tento typ mikroskopie je založen na fázovém kontrastu (kolísání světla) způsobeném difrakcí světla. Bezbarvé, průhledné vzorky, např. živé tkáně a buňky, je obtížné zobrazit s využitím světlého pole, vytvářejí však fázový kontrast kvůli jejich rozdílným indexům lomu nebo tloušťkám. Převod tohoto kontrastu na kontrast jasu umožňuje tento typ vzorku pozorovat.
Je možné prohlížet živé vzorky, protože se nemusí obarvovat. Tento typ mikroskopie osvětluje vzorek pomocí polarizace (vychýlení směru vibrací světla) a využívá dvě polarizační desky, které lze při pozorování otáčet. Pokud jsou desky rovnoběžné, vzorek se jeví jako světlý; pokud jsou desky kolmé, vzorek se jeví jako tmavý. Tento typ mikroskopie je vhodný pro pozorování plátků skály a minerálů k identifikaci jejich krystalových struktur. Využívá se také k pozorování vláken, polymerů, polovodičů a kostních tkání.
Mikroskopie s diferenciálním interferenčním kontrastem (DIC) je stejně jako mikroskopie s fázovým kontrastem vhodná pro pozorování bezbarvých, průhledných vzorků. Liší se v zobrazovací technice, protože DIC převádí rozdíl v tom, jak se světlo šíří, na změny jasu, zatímco fázový kontrast využívá světelnou difrakci. Je vhodná pro pozorování relativně silných vzorků a umožňuje také 3D zobrazování.
Modulační kontrastní mikroskopie, nazývaná také reliéfní kontrastní mikroskopie, je vhodná pro pozorování bezbarvých, průhledných vzorků. Modulační kontrast převádí rozdíl ve výškách povrchu vzorku na kontrast jasu za účelem pozorování. Stejně jako u diferenciálního interferenčního kontrastu lze obraz pozorovat ve 3D, přestože principy se liší. Dalším rozdílem je, že modulační kontrastní mikroskopie umožňuje použití plastových nosičů, což v případě diferenciálního interferenčního kontrastu možné není. Tento typ mikroskopie využívá odražené světlo k pozorování vzorků, které nepropouštějí světlo, např. hornin a minerálů.
Díky ponoření vzorku do indexového oleje se při mikroskopii s disperzním barvením provádí pozorování pomocí detekce rozptylu světla podle různých indexů lomu oleje. Používá se především k identifikaci azbestu a jeho typů.
5. 4. 1995 Je obecně známo, že optický mikroskop má jednoznačně určenu hranici nejmenších pozorovatelných detailů jako polovinu vlnové délky záření použitého k zobrazení. Mluvíme o rozptylovém omezení. Jeho hodnota činí 0,2 až 0,4 mikrometru pro viditelné světlo. V nedávné době se však podařilo rozptylový limit obejít neobyčně důmyslným zařízením, tzv. rastrovacím optickým mikroskopem blízkého pole (scanning near-field optical microscope - SNOM). Tento mikroskop patří do rodiny moderních rastrovacích mikroskopů, jako jsou rastrovací tunelovací mikroskop (STM; za něj získali Binning a Rohler Nobelovu cenu v roce 1982) nebo mikroskop atomárních sil (AFM), které jsou všechny založeny na pohybu velmi jemné sondy v těsné blízkosti povrchu vzorku (pomocí piezoelektrických posuvů). SNOM musí osvětlovat vzorek ze vzdálenosti menší, než je vlnová délka použitého světla, a to optickým vláknem zakončeným otvorem opět menším než vlnová délka (velikost otvoru určuje maximální možné rozlišení, obvykle má průměr 0,05 - 0,15 mikrometru). Detegovat pak můžeme světlo prošlé vzorkem, rozptýlené či sledovat fluorescenci vyvolanou osvětlením v blízkém poli (pojem blízké pole označuje elektromagnetické pole - zde světlo - ve vzdálenosti od zdroje a v šířce menší, než je vlnová délka vlnění, kde se ještě neuplatní rozptyl). A toto je právě největší výhoda mikroskopu SNOM. Dává nejenom obraz vzorku, ale v každém bodě zároveň umožňuje měřit různá optická spektra nesoucí v sobě velké množství dalších informací, např. V průběhu roku 1994 se objevily zprávy o zobrazení jednotlivých molekul mikroskopem SNOM a později měření fluorescenčních excitačních spekter molekul pentacenu v krystalu p-terpenylu (Physical Review B 73, 2764, 1994). Nyní tedy existuje fantastická možnost posvítit si na jednu molekulu a sledovat její individuální chování a interakce s okolím bez rušivého středování vyplývajícího v klasické spektroskopii z účasti velkého počtu molekul různě se projevujících na ději.
Rozlišovací schopnost objektivu je nejmenší vzdálenost dvou bodů (nebo dvou čar), které je daný objektiv schopen zobrazit jako dva od sebe oddělené obrazy bodů (resp. čar). Čím větší je numerická apertura (N. A. Čím je při jistém zvětšení objektivu větší jeho N. A., tím má jím vytvořený obraz větší jas. Paprsky ze všech bodů předmětu scházejí se do nejužšího svazku v místě, kam pozorovatel intuitivně umisťuje zornici svého oka. Zorné pole (FOV, field of view) je rozsah objektu, který lze vidět příslušnou optickou sestavou. (Volná) pracovní vzdálenost objektivu je hloubka prostoru mezi čelem optiky objektivu a zaostřenou předmětovou rovinou. Za horní mez užitečného zvětšení mikroskopu se považuje tisícinásobek N. A. (numerické apertury) jeho objektivu. Zvětšení ještě větší nazývá se „prázdné zvětšení“, protože už nezviditelňuje další detaily předmětu a obraz vypadá jako rozmazaný. Rozlišovací schopnost objektivu závisí na jeho numerické apertuře a ta zase závisí na indexu lomu prostředí mezi pozorovaným objektem a čelní čočkou objektivu.
Má-li toto prostředí větší index než vzduch, objektiv zachytí více světla a vytvoří jasnější a podrobnější obraz. Vzduch má poměrné malý index lomu (n = 1) a je-li prostor mezi objektem a objektivem vyplněn vzduchem, pracují objektivy s malou N. A. poměrně velmi dobře. Ale objektivy s velikou N. A. potřebují mezi objektem a objektivem prostředí v větším indexem, což je např. imerzní olej.
Má-li však takovýto objektiv plně ukázat své přednosti, je třeba spojit imezním olejem nejen objekt resp. jeho krycí sklo s objektivem, nýbrž i objekt resp. jeho podložní sklo je třeba spojit olejem s plochým čelem kondenzoru. Olejové imerzní objektivy mají na sobě nápis „oil“ nebo „Oel“.
Objektivy pro pozorování v temném poli nesmějí mít větší N. A., než je N. A. speciálního kondenzoru použitého pro osvětlení preparátu (ta je též omezena indexem lomu prostředí mezi čelní čočkou kondenzoru a podložním sklem preparátu), protože jinak by prázdné pole kolem svítících struktur nezůstalo temné. Irisová clona v objektivu umožní snížit jeho aperturu „ad hoc“ a tak dosáhnout temnoty prázdného pole. Většinou pro pozorování v procházejícím světle potřebujete pro temné pole pouze středovou clonu do kondenzoru.
Ta značka znamená krycí sklo preparátů; předpisuje pro ně tloušťku 0,17 mm, jak ji předpokládal konstruktér objektivu při svých výpočtech korekcí vad optických. Ta označuje, že výpočet korekcí optických vad objektivu předpokládal, že vzdálenost od dorazové plochy vešroubovaného objektivu ke konci tubusu (k dorazu pro okulár) bude 160 mm.
Paprsky vycházející z bodu v rovině předmětové se v obrazovém prostoru neprotínají v nějakém bodu nýbrž směřují k bodu nekonečně vzdálenému a zůstávají tedy spolu rovnoběžné. Obraz tedy musíme pozorovat dalekohledem, jehož objektiv (zvaný tubusová čočka) je nedaleko nad objektivem mikroskopu.
Tlačí se, že barevná teplota je „teplá“ a světlo je nažloutlé. To je nejprostější a nejčastěji používaný způsob mikroskopování ve škole, v průmyslu i na poli lékařském. Aperturní clonou se reguluje velikost prostorového úhlu kužele světla, které osvětluje pozorovaný preparát, což ovlivňuje vlastnosti mikroskopického obrazu, které určují jeho kvalitu: kontrast, hloubku ostrosti a rozlišení podrobností.
Je jednoduchá clona, u které je regulace množství světla, které osvětluje pozorovaný objekt, zajištěna otáčením disku, který je vybaven několika otvory různých velikostí. Je clona složená z lamel, jejichž přiblížením nebo oddálením se zmenšuje či zvětšuje otvor, kterým prochází světlo. Tím dochází k regulaci intenzity osvětlení pozorovaného objektu.
Polní clonou se reguluje osvětlená oblast v zorném poli. Je nezbytnou součástí speciální metody mikroskopie - pozorování v polarizovaném světle.
V praxi se používá dvojice polarizačních filtrů - tzv. polarizátor a analyzátor, z nichž jeden je pevný a druhým se otáčí okolo svislé osy, čímž dochází ke změně úhlu kmitání světla. Jsou-li roviny polarizace obou filtrů k sobě rovnoběžné, světlo jimi normálně prochází a zorné pole mikroskopu je světlé. Jsou-li na sebe naopak kolmé (zkřížené) světlo analyzátorem neprojde a zorné pole je tmavé.
Je nejmodernější typ osvětlení, vybavený LED diodami, které vydávají bílé světlo se spektrem denního světla. Je mikroskop, vybavený binokulární hlavicí, tj. Je nejmodernější přístroj s digitální kamerou zabudovanou přímo do optické hlavice. Tyto mikroskopy mají optickou soustavu oproti běžným mikroskopům obrácenou, tzn., že objektiv je pod pozorovaným objektem a osvětlovač nad ním. Je mikroskop, vybavený monokulární hlavicí, tj. Je mikroskop, vybavený trinokulární hlavicí, tj. Mají korigovanou barevnou vadu pro 2 barvy, optimální barevní korekce je provedena pro žlutozelenou oblast spektra, na kterou je lidské oko nejcitlivější.
Achromatické objektivy jsou nejekonomičtější objektivy, mohou však být výhodné např. Objektiv s delší pozorovací vzdáleností (vzdáleností mezi objektivem a pozorovaným objektem) než u běžných objektivů. Jsou gumové násadky na okuláry speciálního tvaru, které zabraňují pronikání bočního světla k okuláru a odstraňují tak jeho rušivý vliv na kvalitu pozorovaného obrazu (např. Jedná se o širokoúhlý okulár se zabudovanou jehlou (ukazatelem), která ukazuje přesně do středu zorného pole. Používá se zejména u žákovských a studentských mikroskopů.
Výhodou je možnost nastavení detailu, který chceme pozorovat, přesně do středu zorného pole. Moderní typ okuláru, při zvětšení 10x má zorné pole obvykle 18 mm, mikroskopy vyšší třídy mají zorné pole 20 mm. Při použití širokoúhlých okulárů vidíme při stejném zvětšení v zorném poli větší část pozorovaného preparátu než při použití starších typů okulárů s menším zorným polem (např. Okuláry mikroskopů vyšší třídy, mají zorné pole 22 - 25 mm. Nejmodernější typ okulárů, tzv. „HIGH EYE-POINT“ okuláry, je možné s nimi pozorovat s brýlemi (bez očnic). Očnice, se kterými se pozoruje bez brýlí, jsou hlubší než u běžných mikroskopů. Tyto okuláry se značí „WFH“, „WH“ nebo symbolem „brýlí“.
Principem takového osvětlení, kterým jsou vybaveny mikroskopy střední a vyšší třídy, je vycentrování všech prvků osvětlovacího systému - zdroje světla, kolektorové čočky a polní clony. Slouží k eliminaci nežádoucích odlesků (prasátek) při pozorování výrazně lesklých předmětů, např. z vybroušeného kovu, broušených minerálů, lesklých krovek brouků, umělých střev, atd. Otáčením jednoho z dvojice filtrů dospějeme do polohy, kdy jsou tyto odlesky zcela eliminovány.
Princip polarizace viz. Je tenký průhledný nebo poloprůhledný řez rostlinnou nebo živočišnou tkání, umístěný na podložním skle ve speciálním médiu (např. solakrylu) a uzavřený krycím sklem. Některé typy preparátů je možné (např. krevní nátěr) či dokonce nutné pozorovat bez krycího skla. Preparáty se pozorují v tzv. světelných mikroskopech (žákovské, studentské, biologické, laboratorní, badatelské mikroskopy) a ve speciálních mikroskopech (např. Krycí sklo je základní potřebou při přípravě mikroskopických preparátů. Uzavírá vzorek rostlinné či živočišné tkáně, umístěný ve speciálním médiu na podložním skle. Podložní sklo je základní potřebou pro přípravu mikroskopických preparátů. Standardní rozměr je 76 x 26 mm s tloušťkou 1,2 mm.
Je speciální mikroskop, určený pro pozorování trojrozměrných neprůhledných předmětů. Tento typ mikroskopů je vybaven nižším zvětšením (obvykle 20 - 50x nebo 100x) než běžné světelné mikroskopy a vrchním osvětlením.
Je souhrnné označení pro osvětlení, která na výstupu produkují pouze světlo, nikoliv teplo. Jakýkoliv předmět, který je možné pozorovat přímo a není nutné jej upravovat do podoby mikroskopického preparátu. s celou řadou novinek, o kterých Vás budeme průběžně informovat. Inovace proběhnou v softwarových platformách i samotných mikroskopech.
V oblasti setereomikroskopie se v posledních letech vývoj u Leica Microsystems zaměřil převážně na CMO mikroskopy (Leica M-serie), vhodné především pro pokročilé zobrazovací metody. Nyní se však pozornost obrátila i na rutinní stereomikroskopy s optickým systémem greenough, které jsou tu pro ty, kteří mikroskopy využívají ke každodenní rutinní praxi. Jak už jsme zmínili v úvodu, nová řada S9 je založena optickém systému greenough.
Tento systém, který je historicky prvním typem stereomikroskopů a někdy je považován za překonaný novějším systémem CMO (common main objective). Systém greenough je založen na dvou oddělených optických cestách, které spolu svírají specifický úhel (u S9 je to 10°), který odpovídá oční sbíhavosti při pohledu na bod v dané vzdálenosti.
Greenough systém má nejostřejší zaostření ve středu zorného pole, kde se kříží roviny ostrosti obou optických cest. Směrem k okrajům se ostrost zhoršuje. Nicméně, mozek při pohledu do okulárů tyto nedostatky vyrovná a obraz se jeví celistvě ostrý. Při práci s kamerou však toto může být zřetelné.
Tyto mikroskopy Vám přinesou nejsilnější 3D vjem a tedy i zvýšenou orientaci v prostoru. Obr. 1: Na rozdíl od CMO optického systému (vlevo) je greenough systém (vpravo) tvořen dvěma zcela oddělenými optickými cestami se specifickým vzájemným sklonem. Díky tomuto sklonu je zaostření soustředěno na střed zorného pole.
Stereomikroskopy řady S9 přináší pro greenough modely dosud nejsilnější poměr zvětšení 9:1. V základní sestavě (10x okuláry a bez předsádky) se můžete pohybovat v rozsahu zvětšení 6,1- 55x! Nyní tak využijete mikroskop jak pro snadný přehled vzorku, tak i pro pečlivý průzkum všech detailů.
Díky okulárům se zorným polem 23 mm obsáhnete při zvětšení 6,1x zorné pole až 37,7 mm. Celá optická cesta nových S9 stereomikroskopů je apochromaticky korigovaná. Tato technologie je postavena na rozdílné apertuře optických kanálů. Do levého oka tak přichází obraz o vysoké hloubce ostrosti a do pravého oka obraz s nejvyšším možným rozlišením.
O zbytek se postará nejvýkonnější počítač - Váš mozek. Ten zkombinuje vlastnosti obou optických kanálů a vytvoří výsledný obraz o nejvyšším rozlišení při vysoké hloubce ostrosti. Vlevo obraz o nízké apertuře s vysokou hloubkou ostrosti, ale s nízkým rozlišením. Uprostřed obraz s vysokou aperturou jež zapříčiní vysoké rozlišení, ale s nízkou hloubkou ostrosti.
Stereomikroskopy řady S9 bude možno využít ve velmi široké škále použití od průmyslových inspekcí a oprav až po biologické aplikace jako jsou mikrooperace, disekce, či transgenní aplikace.
Takto široká škála využití však vyžaduje i přizpůsobivost k nárokům, které před mikroskop dané aplikace pokládají. Mikroskop tak lze dovybavit přídavnými objektivy (tzv. předsádkami), které posunou rozsah zvětšení dle potřeb uživatele. Všechny tyto objektivy jsou také apochromaticky korigované a zachovají tak vysoko nasazenou laťku obrazové kvality. Momentálně jsou v nabídce předsádky se zvětšením 0.5x, 0.63x, 0.75x, 1.6x a 2x.
Každá předsádka změní i velikost zorného pole a pracovní vzdálenost. Pro přehlednost proto přikládáme tabulku hodnot. Mikroskop lze vybavit i různými okuláry (10x, 16x, 20x, 25x a 40x) a dosáhnout tak velmi variabilních hodnot.
Obr. 3: Přehledová tabulka rozsahů zvětšení v závislosti na zvolených okulárech (udává řádky tabulky) a předsádkách (udávají sloupce tabulky). První sloupec je varianta bez předsádek. Lze si povšimnout, jak se v závislosti na zvolených předsádkách mění hodnoty pracovní vzdálenosti.
Stereomikroskopy řady S9 lze kombinovat s širokou škálou dosavadního vybavení Leica. Můžete tak svůj mikroskop nakonfigurovat s moduly z portfolia transmisních základen, dopadajícího osvětlení, nebo nosných sloupců. Mikroskop můžete nakombinovat s manuálním ostřením, i verzí s hrubým/jemným posunem, nebo motorizovaným posunem s možností ovládání pomocí nožního pedálu - ideální kombinací pro Vás, kteří potřebujete volné ruce pro práci s preparáty.
Možnost připevnění mikroskopu na flexibilní rameno zase umožní umístit mikroskop v libovolné pozici nad pracovní deskou. Řadu S9 reprezentují tři výchozí modely, které lze dále přizpůsobovat vašim požadavkům. Binokulární model určený čistě pro práci bez nutnosti dokumentace. Model s optickým portem pro nasazení libovolné kamery, nebo fotoaparátu přes c-mount rozhraní. Optimální řešení pro stávající majitele kamer, nebo pro možnost pozdějšího rozšíření.
Model s integrovanou, barevnou 10 mpix kamerou s rychlostí až 35 snímků za vteřinu. Kamera je vybavena různými datovými výstupy, USB portem pro připojení do PC a využití síly softwarové platformy LAS, nebo HDMI portem pro přímé připojení do monitoru bez nutnosti použití PC. Kamera je rovněž vybavena ethernetovým portem, díky kterému snadno nasdílíte výstup do Vaší sítě, nebo pomocí routeru připojíte libovolné mobilní zařízení. Stačí zdarma stáhnout aplikaci Leica AirLab (android, iOS) a můžete pomocí mobilních zařízení pozorovat Váš objekt, pořizovat, upravovat a sdílet snímky a videa, nebo ovládat nastavení kamery.
Díky integrované konstrukci má tento model čistý a úsporný design bez překážejících kabelů. Integrovaný model je navíc oproti kamerám se srovnatelnými parametry (např. Obr. 5: Zástupci řady Leica S9.
tags: #sere #pole #v #mikroskopu