Konfokální mikroskopy obsahují dírku před osvětleným prvkem, která blokuje okolní a neostré světlo. To umožňuje mikroskopu použít polohu, která odráží nejintenzivnější světlo, jako skutečnou výšku. Konfokální mikroskopy propouštějí světlo přes čočku objektivu na cíl. Zaostřeno je pouze světlo procházející dírkou; zbytek světla z konfokálního mikroskopu je absorbován oblastí masky. Pokud cíl není v ohnisku, je světlo zaostřeno na bod odkloněný od dírky, což rozšiřuje světelný paprsek z konfokálního mikroskopu, takže světlo již není zaostřeno na samotnou dírku. To znamená, že se sníží množství světla, které dopadá na osvětlený prvek. Konfokální mikroskop detekuje, zda je cíl v ohnisku na základě intenzity odraženého světla, které se vrací do osvětleného prvku.
Tenhle snímek bude asi mnohem koukatelnější a zajímavější než jen „obyčejné“ buňky. Preparát jsem nedělal, byl zapůjčen Nikonem při testování nového systému na jaře. Jde o pylová zrna lile v prašnicích - je to preparát trvalý, fixovaný. Snímáno cca 30 konfokálních řezů o celkové tloušťce 24 µm. Jde o prostorovou projekci. Doostřeno Gauss-Laplaceho metodou.
Ve fluorescenci je zdrojem záření výbojka nebo jiný zdroj spojitého záření (u nás CoolLED diodový zdroj). U konfokální mikroskopie jsou zdrojem záření lasery o určitých vlnových délkách. Světlo jde na vzorek a z něho přes objektiv, dichroické zrcátko a emisní filtr na detektor. Vzorek je skenován lasery (proto CSM = confocal scanning microscopy) - tzn. V uplynulých dvaceti letech zaznamenala optická mikroskopie pozoruhodný rozmach, a to jak v důsledku vysoké kvality nových objektivů navrhovaných počítači, tak díky spojení mikroskopů s vyspělou videotechnikou a následným zpracováním obrazů výkonnými mikropočítači či laserovými zdroji světla.
Technický pokrok pozměnil optickou mikroskopii do té míry, že je dokonce patrná jistá renesance jejího užití v buněčné biologii, kde v poválečném období jednoznačně dominovala mikroskopie elektronová. Optický mikroskop obyčejný se skládá z objektivu, který vytváří zvětšený, převrácený obraz zkoumaného předmětu, a okuláru, jímž tento obraz pozorujeme jako lupou. Další důležitou částí mikroskopu je zdroj světla s kondenzorem. Zkoumané předměty lze vidět jen díky tomu, že zobrazující záření s nimi nějakým způsobem interaguje. Světlo může být pozorovaným objektem částečně absorbováno, jindy se spíš lomí, odráží nebo rozptyluje, při průchodu objektem se mění fáze světelného vlnění, někdy i jeho polarizace. Některé objekty také mohou emitovat fluorescenci. Skutečnou roli určitého optického jevu, a tím i vzhled obrazu, však nakonec určuje zejména volba mikroskopické techniky. Pro srovnání s konfokálním mikroskopem není podstatné, jaká je povaha technických rozdílů mezi jednotlivými metodami.
Rozlišovací schopnost a prostorové zobrazení
Rozlišovací schopnost mikroskopu je minimální vzdálenost dvou bodů objektu, které se ještě zobrazí jako navzájem oddělené. Žádný objektiv nemůže zobrazit bodový objekt opět jako bod. I při dokonalé korekci všech možných vad zobrazení, které souvisí s technologií výroby objektivů, jsou obrazem bodu Airyho kroužky. Při zobrazení dvou blízkých bodů se mohou jejich Airyho kroužky překrývat, až se při jisté minimální vzdálenosti stanou téměř nerozlišitelnými. Tato mez se běžně odhaduje dle Rayleighova kritéria. Pro modré světlo se teoretická rozlišovací schopnost blíží hodnotě kolem 0,17 µm.
Skutečné mikroskopické objekty jsou trojrozměrné. Teoretické rozlišovací schopnosti lze plně využít jen v případě vzorků o tloušťce menší než hloubka ostrosti objektivu. Při zkoumání silných vzorků, například tkáňových řezů, je kvalita zobrazení ovlivněna překrýváním rovin. Idea konfokálního mikroskopu pochází od Marcina Minského, který ji patentoval v roce 1957. O deset let později Petráň a Hadravský patentovali konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče. Tandemový konfokální mikroskop se v praxi nerozšířil výrazně, Éra konfokální mikroskopie začíná až koncem sedmdesátých let s prvním spolehlivým konfokálním mikroskopem s rozmítaným laserovým paprskem.
Princip činnosti spočívá v tom, že vzorek je osvětlen bodovým zdrojem a obraz je získáván clonou, která je objektivem zobrazena na vzorek. Stejný objektiv pak sbírá světlo odražené nebo emitované fluorescencí. Po zpětném průchodu vznikne obraz bodové clony, který je lokalizován před fotonásobič. Existují tři základní metody rastrování: rozmítání laserového paprsku, příčné posouvání vzorku, nebo posouváním objektivu nad vzorkem. Tímto způsobem se získává optický obraz rovin zkoumaného vzorku.
Při rastrování je měřená intenzita světla registrována počítačem spolu s informací o souřadnicích. Díky prostorové filtraci záření dopadajícího na detektor neobsahuje obraz neostré pozadí. S objektivem o numerické apertuře ~1,3 a při použití modrozelené čáry argonového laseru se tloušťka optických řezů pohybuje kolem 0,4 µm. Vertikální posun vzorku umožňuje zobrazovat řez ve více hloubkách pod povrchem.
Výhody a omezení konfokální mikroskopie
Porovnání s widefield mikroskopií ukazuje potlačení signálu ze vzorku mimo ohniskovou rovinu, což zajišťuje ostrý obraz jedné ohniskové roviny. Rotující disk (Nipkowův disk) umožňuje rychlé snímání s vysokým rozlišením. U konfokálního mikroskopu se díky detekci z konkrétní roviny získává jasný obraz i u silnějších vzorků a zachovává se vysoký kontrast.
Konfokální zobrazování se může kombinovat s různými detektory a metodami rekonstrukce; prostorová rekonstrukce z desítek až stovek řezů umožňuje vznik 3D modelů a stereoskopických párů. Nové metody zahrnují současné snímání fluorescenčních obrazů pomocí tří fotonásobičů pro modrou, zelenou a červenou barvu. Při použití confokálního zobrazení vznikají 3D vizualizace, které jsou užitečné například pro studium trojrozměrné struktury buněk a sítí.
Pro materiálový výzkum se konfokální mikroskopie využívá ke studiu povrchových vlastností, textury a eroze, stejně jako k vyhodnocení výšky struktur na polovodičových čipech a měření výšky elementů. V biologii se konfokální mikroskopie stala nedestruktivním nástrojem pro studium prostorových struktur buněk a tkání a umožňuje například zkoumat intracelulární koncentrace iontů, měřit membránový potenciál a vnitrobuněčné pH. Imunofluorescenční metody pak umožňují mapovat rozložení receptorů v membránách či strukturu cytoskeletu a endoplazmatického retikula.
Aplikace v praxi a případová studie
Vzorek s trojrozměrným rozlišením je využíván například při studiu architektury neuronových sítí v mozkové tkáni. Konfokální mikroskop umožňuje sledovat barvení Golgiho metodou a studovat intracelulární procesy v prostorové dimenzi. Mirava Polyscope od Abberior Instruments představuje superrezoluční technologii, která kombinuje tři klíčové přístupy - superrezoluci, FLIM a adaptivní optiku - a rozšiřuje možnosti mikroskopického zobrazení v rostlinném a biologickém výzkumu.
Nekonvenční a pokročilé konfokální systémy umožňují zpracování obrazů v Imaris a dalších softwarech pro 3D rekonstrukci a kvantitativní analýzu. Ve světovém kontextu představují konfokální mikroskopy standard moderního biomedicínského výzkumu, zejména v integraci s videotechnikou a výkonnými počítači, které zpracovávají velká data z obrazových řezu.
Konfokalni mikroskop
Do laboratoře rostlinných biologů dorazil nový superrezoluční mikroskop, který kombinuje tři pokročilé technologie a nabízí ostřejší snímky i sledování interakcí molekul v buňkách. ÚEB AV ČR je členem Czech-BioImaging a nákup byl financován z Operačního programu Jan Amos Komenský pro výzkumné infrastruktury. Zdrojem světla u konfokálního mikroskopu je laser, který osvětluje preparát a světlo po průchodu objektivem prochází zpět k detekci skrze dírku v cloně, čímž se dosahuje konfokality obrazu.
Výhody konfokálního zobrazování zahrnují potlačení signálu mimo ohniskovou rovinu a možnost tvorby 3D modelů preparátu. Nevýhodou bývá vyšší expozice vzorku laserovému světlu, což může vést k fotobleachingu a zpožděnému snímání při vysokém rozlišení. Proto je důležité optimalizovat dobu expozice, počet řezů a rychlost skenování podle charakteristik vzorku.
tags: #fluorescencni #a #konfokalni #mikroskopie #sehadova