Může obsahovat prvky reklamy dle definice zákona č. 40/1995 Sb. Při zkoumání vzorků při vysokém zvětšení pomocí mikroskopu je třeba vzít v úvahu řadu faktorů. V tomto článku se stručně podíváme na to, jak použití média mezi krycím sklíčkem a přední čočkou objektivu pomáhá zvýšit NA a rozlišení. Kromě toho vezmeme v úvahu index lomu vzduchu a skla, ze kterého se skládají diapozitivy a krycí skla. Dále se budeme zabývat použitím média ohledně snížení chybovosti ve chvíli, kdy světlo prostupuje z jednoho média do druhého. One - jedním z hlavních problémů ve světelné mikroskopii je překonat některé limity optického rozlišení a zvýšit NA systému. Rozlišením a NA se však budeme zabývat v jiných článcích. Ponořením objektivu do kapaliny na místo vzduchové mezery mezi čočkou objektivu a krycím sklem vzorku zvyšujeme rozlišení objektivu. Když světlo prochází z jednoho média do druhého (například skrz sklo do vzduchu), láme se - jinými slovy, ohýbá se a rozptyluje. Žádné světelné paprsky, které se lámou do vzduchu, odrážejí se od krycího skla nebo jsou blokovány kovovým pouzdrem přední čočky objektivu, nepřispívají k tvorbě kvalitního obrazu.
Vlevo: Když světlo prochází dvěma médii s různými indexy lomu (například skrz sklo do vzduchu), láme se. Fyzikální vlastnosti vzorku, kterým prochází světelné paprsky, určují „index lomu.“ Index lomu je číselná hodnota (bez jednotek), která určuje, do jaké míry se bude světlo lámat při průchodu materiálem. Vzduch má index lomu 1,0, zatímco podložní sklíčka a krycí skla mikroskopů mají obvykle index lomu 1,5. Vezmeme-li v úvahu tento rozdíl, účelem imerzní kapaliny je co nejpřesněji srovnat index lomu skla, ve kterém je vzorek namontován, čímž se zvýší množství světelných paprsků, které vytvoří konečný obraz. Proto má většina imerzních olejů index lomu 1,51. Ideálním scénářem je vytvořit takzvaný „homogenní imerzní systém“. Pomocí tohoto systému je možné dosáhnout maximálního rozlišení a NA. Účelem homogenního imerzního systému je, co nejpřesněji srovnat index lomu a NA objektivu, imerzního média, krycího skla, montovacího média a čočky kondenzoru (viz obr. Přidání imerzní kapaliny na čočku kondenzoru není nutné.
Obrázek 2: Indexy lomu všech optických prvků mezi vzorkem a čočkou objektivu mají zásadní vliv na kvalitu obrazu. Jedním z dalších faktorů, které je třeba vzít u objektivů mikroskopu, je „pracovní vzdálenost“. Jedná se jednoduše o skutečnou vzdálenost mezi přední čočkou objektivu a povrchem krycího skla, když je vzorek zaostřen (viz obr.). Mezi pracovními vzdálenostmi a zvětšením každého objektivu existuje inverzní vztah. Například 10x objektiv může mít pracovní vzdálenost 4 mm, zatímco pracovní vzdálenost 100x olejového objektivu bude typicky v oblasti 130 mm. Pro srovnání, některé imerzní vodní objektivy nebo ponorné vodní objektivy nabízejí pracovní vzdálenosti kolem 3 mm.
Pro rozhodující faktor, který si musíte pamatovat při použití objektivů s olejem, je použití správně sladěného imerzního oleje. Po mnoho let se běžně používal olej z cedrového dřeva (ten je stále komerčně dostupný). Ačkoli má tento olej index lomu 1,516, má tendenci tvrdnout a může způsobit poškození čoček, pokud nebude po použití odstraněn. Většina moderních olejů je vyráběna synteticky a standardizována, aby se zajistilo, že nepoškodí čočky nebo nezmění s věkem barvu. Je třeba mít na paměti, že imerzní olej má optimální pracovní teplotu. Většina komerčních syntetických olejů je navržena pro práci při 23 °C a změna pouze o 1 °C bude mít za následek změnu indexu lomu 0,0004. Při použití olejových imerzních objektivů (viz obr. 4) pro fluorescenční mikroskopii se doporučuje použít speciální fluorescenční olej. Mnoho olejů může za určitých podmínek fluoreskovat.
• Při pohledu ze strany mikroskopu opatrně naneste jednu kapku imerzního oleje přímo na krycí sklo. Vsuňte objektiv s největším zvětšením na místo, použijte hrubé a poté jemné zaostření, aby se čočka objektivu dostala do kontaktu s olejem. • Poté se můžete znovu podívat do okulárů. K nastavení zorného pole používejte pouze jemné zaostření. • I když poté plánujete zkoumat další vzorky, měli byste v této fázi vždy odstranit z objektivu olej, abyste zabránili možné kontaminaci ostatních částí mikroskopu. Imerzní olej může (a bude) pronikat a může tak poškodit součásti a objektivy mikroskopu, které nejsou vhodné pro ponoření do oleje. Přebytečný olej odstraňte čistícím ubrouskem na čočky jediným plynulým pohybem přes čočku. Méně častým objektivem je tzv. imerzní vodní objektiv, který poznáte dle značení na objektivu písmenem „W“ nebo „WI“. Imerzní vodní objektiv se velmi doporučuje při zobrazování živých buněk, které jsou v buněčném médiu. Existují dva typy vodních imerzních objektivů (viz obr. Tzv. „water dipping“ (ponorné objektivy) objektivy se běžně používají ve svislé konfiguraci mikroskopu a používají se k přímému ponoření do vody nebo vodného média / pufru. Water dipping objektivy jsou vyráběny tak, aby poskytovaly velmi dlouhou pracovní vzdálenost.
Jednou z výhod použití imerzních vodních objektivů je jednoduše to, že se jako médium používá voda. Je zřejmé, že se snadno nanáší a čistí. Při použití vodních imerzních objektivů však existují určité nevýhody. Olejové imerzní objektivy dosahují vyššího rozlišení než vodní imerzní objektivy. Navíc díky viskozitě vody (ve srovnání s olejem) může být použití vodních imerzních objektivů náchylné na vibrace a malé pohyby vzduchu. Takové artefakty lze překonat zajištěním umístění mikroskopu na antivibrační stůl. Jednodušším řešením je také umístit speciální prstenec přes krycí sklo, který vytvoří kapku vody. Další nevýhodou vodních imerzních objektivů je jejich cena. Společnost Leica nabízí mikroobjemový dávkovač vody, který překonává potenciální problém s odpařováním vody během dlouhodobých experimentů se zobrazováním živých buněk nebo screeningovými experimenty (viz obr.).
Hlavní výhoda imerzních vodních objektivů přichází při zobrazování živých buněk a tkání. Živé buňky jsou obvykle obsaženy v komoře a jsou pokryty buněčným médiem (nebo pufrem). Komora a médium pomáhají zajistit, aby byly buňky nebo tkáň během zobrazování udržovány ve stabilním prostředí. V důsledku toho bude optimální ohnisková vzdálenost v relativně velké vzdálenosti od povrchu komory. Navzdory lomu, který může nastat na rozhraní vody, skla nebo plastu, jsou vodní imerzní objektivy obvykle korigovány. Některé vodní imerzní objektivy mají navíc korekční objímky. Leica také nabízí motorizované korekční límocové objektivy, které umožňují přesné nastavení objektivů, a které zajišťují obnovení optimálního rozlišení s minimálním narušováním vzorků a nastavení zobrazení (viz obr. Obrázek 7: Korekční límec umožňuje přizpůsobení objektivu různým tloušťkám krycích skel.
A konečně, jednou z nejvhodnějších aplikací vodních imerzních objektivů je konfokální zobrazování živých buněk. Jako takové jsou obvykle jednou ze standardních funkcí mnoha konfokálních systémů. Glycerol je další možné imerzní médium. Mnoho fixovaných vzorků je namontováno v Mowiolu, Vectashieldu nebo podobných směsích na bázi glycerolu (viz tabulka 1). Tato média mají indexy lomu blízké indexům lomu směsi 80/20 glycerol / voda (RI = 1,45). Zvětšení až 1000x, případně 1500x.
Nosíme se dále s praktickými poznámkami: knoflíky a dráhy světlého a tmavého pole, kondenzory Köhlerova osvětlení, apertury kondenzoru a volba podle tloušťky krycího skla. Přizpůsobení tloušťky krycího skla objektivu je klíčem k získání čistého obrazu. Při nesprávné tloušťce může obraz vypadat rozmazaně. Imerzní médium mezi čočkou a vzorkem hraje klíčovou roli pro dosažení vyššího rozlišení a jasnosti obrazu. Obecně platí: olejová imerze poskytuje vyšší NA, vodní imerze je vhodná pro živé vzorky a pro prostředí s vodou, zatímco vzduchové prostředí bývá nejlevnější, ale má nejnižší NA.
Standardní sekvence zvětšení a volba pro praxi zahrnuje 4×, 10×, 40× a 100× olejové imerze; celkové zvětšení s okulárem 10× a objektivy 4×, 10×, 40× a 100× dosahuje součtu 40× až 1000×. Přehled o údržbě a praktických postupech doporučuje po použití olejové imerze očistit objektiv jemným papírem na čočky a čistícím roztokem; zbytky oleje je třeba odstranit, aby nedošlo k kontaminaci dalších částí mikroskopu. Objektivy skladujte v suchu a vyhýbejte se kontaktu s agresivními chemikáliemi; manipulujte s nimi čistýma rukama nebo v rukavicích, aby se nepoškrábaly.
Rychlá odpověď na často kladené otázky:
- Jaké jsou hlavní typy mikroskopických objektivů? Odpověď: Mezi hlavní typy patří achromatické, planachromatické, fluoritové, planfluoritové, semiapochromátové a apochromátové objektivy. Každý typ nabízí různé úrovně korekce aberace a kvality obrazu.
- Jak si mohu vybrat správné zvětšení pro svou aplikaci? Odpověď: Zvolte zvětšení podle svých potřeb. Nižší zvětšení (4x-10x) je dobré pro všeobecné pozorování, zatímco vyšší zvětšení (40x-100x) je lepší pro detailní kontrolu a výzkum.
- Co je numerická apertura a proč je důležitá? Odpověď: Numerická apertura (NA) měří schopnost objektivu shromaždit světlo a rozlišovat jemné detaily. Vyšší NA znamená lepší rozlišení a jasnější snímky, což je zásadní pro zobrazení s vysokými detaily.
- Mohou olejové imerzní objektivy použít se vzorky na vodní bázi? Odpověď: Ne, olejové imerzní objektivy jsou určeny pro použití s olejem. Pro vodné vzorky použijte objektivy ponořené do vody.
- Jak mohu čistit a udržovat objektivy? Odpověď: Objektivy jemně očistěte papírem na čočky a vhodným čisticím roztokem. Manipulujte s nimi čistýma rukama nebo rukavicemi, aby se nerozmazaly. Správně je skladujte a pravidelně kontrolujte, zda nejsou poškozeny.
Jste připraveni posunout svou mikroskopii na další úroveň a vybrat správný objektiv pro vaše vzorky a metody? Ponořte se do světa imerzních a suchých objektivů a objevte, jak volba média, indexů lomu a korekcí formuje výsledný obraz.
