V řadě stanovení v biochemii se využívá skutečnosti, že mnoho látek pohlcuje elektromagnetické záření ve viditelné nebo ultrafialové části spektra, méně často infračervené záření. Míra, jakou látka pohlcuje světlo různých vlnových délek (tj. absorpční spektrum) závisí na struktuře sloučeniny. Množství světla určité vlnové délky, které pohltí např. látka rozpuštěná v roztoku, závisí na koncentraci látky. Řada látek obsahuje valenční elektron, který může být excitován do vyšší energetické hladiny elektromagnetickým zářením. Taková látka pak absorbuje záření o určité vlnové délce s energií fotonů odpovídající rozdílu energií obou elektronových hladin. Předpovědět barvu látky na základě její chemické struktury bohužel není jednoduché, ani není možné na základě absorpčního spektra jednoznačně usuzovat na složení látky.
Související chemické mechanismy se ilustrují na příkladech konjugovaných systémů a přítomnosti různých centrálních atomů. Látky obsahující systém konjugovaných dvojných vazeb, jejichž molekula není symetrická, mohou existovat ve dvou rezonančních stavech; asymetrický substituent vyvolává rozdíl energií stavů, který často odpovídá energii fotonu z viditelné části spektra. Typickými zástupci bývají barviva s polymethinovým řetězcem nebo azobarviva. Podobně se chovají i látky s aromatickými či heterocyklickými strukturami vázanými na společný centrální atom; d a f valenční elektrony často podmiňují barvu sloučeniny. Bývají přítomny v koordinačně kovalentních vazbách komplexních sloučenin.
Analytické metody používané v lékařské chemii a biochemii využívají všech tří skupin barevných sloučenin. Systémy konjugovaných dvojných vazeb často vznikají v reakcích, v nichž analyt kondenzuje s vhodným chromogenem, nebo vznikají oxidací chromogenu. Tvorby barevných komplexů se využívá např. při stanovení bílkovin biuretovou reakcí nebo při průkazech řady látek FeCl3. Změny barvy při redukci Cr6+ na Cr3+ lze využívat při různých analytických procesech. Absorpce monochromatického světla může být podmíněna i jinými ději než excitací elektronu, například změnami oscilačních nebo rotačních energií; tyto procesy se častěji uplatňují ve fluorimetrii.
Transmitance a absorbance jsou klíčové veličiny v fotometrii a spektrofotometrii. August Beer (1825-1863) formuloval transmitanci závislou na vlastnostech vzorku a prostředí; Lambertův-Beerův zákon pak propojuje absorbanci s koncentrací. Pro měření veličin jako absorbance a transmitance, ale někdy i turbidance, se používají fotometry a spektrofotometry. Zařízení, která měří při jedné či několika přesně definovaných vlnových délkách monochromatického světla, označujeme jako fotometry. Žárovky a halogenové žárovky poskytují záření o spojitém spektru ve viditelné a infračervené oblasti, ale pro UV region je třeba specifických zdrojů a materiálů kyvet.
Jako zdroje UV záření se používají nejčastěji vodíkové nebo deuteriové výbojky; zdrojem UV i viditelného světla může být také polychromatické světlo následně procházející monochromátorem. Komerčně dostupné jsou dnes filtry pro ultrafialovou a viditelnou oblast; rozlišují se typy filtrů (low-pass, high-pass, pásmové filtry). Monochromátor často bývá založen na optické mřížce; jeho štěrbina určuje šířku pásma a tedy i rozlišovací schopnost. Čím je štěrbina užší, tím je spektrum ostřejší a světla méně, srovnatelně vyšší citlivost měření vyžaduje dobrou souhru s detektorem a vzorkem.
Pro měření UV-Vis se obvykle používají kyvety s optickou dráhou 1 cm; pro UV průchodnost je nutné křemenné sklo, zatímco klasické sklo či plast mohou blokovat části UV spektra. Rozsah vlnových délek, které z monochromátoru vycházejí, určuje štěrbina a typ kyvety; délka dráhy ovlivňuje absorbanci vzorku. Delší dráha pomáhá u vzorků s nízkou koncentrací, kratší pro velmi koncentrované roztoky. Měření se může provádět v jedné kyvetě nebo v mikrotitračních destičkách, kde se měří svislým paprskem a objemy jsou malé, obvykle 100-300 μl. Mikrotitrační destičky jsou levnější a rychlejší, trvá měření všech 96 jamek jen několik vteřin.
V mikrotitrační režii se používá čtečka destiček, která je vhodná pro rychlé a opakovatelné měření. Při klasické fotometrii je důležité mít kyvety čisté a nepoužívat otisky prstů na optických plochách; destičky pro mikrotitrační měření vyžadují méně objemů a srovnání více vzorků je jednodušší. Pro větší přehlednost se při fotometrii svislým paprskem používá pojem optická hustota OD. Reflexní fotometrie slouží jako alternativa v klinické biochemii; používá suchou chemii a měří úbytek světla odraženého od políčka na filmu.
Významná část praktických metod spočívá v čistotě vzorků a správné přípravě roztoků. Důležité je zajistit homogenní vzorek, filtraci/ odstředění, kontrolu pH a koncentrace, aby byl vzorek v lineárním rozsahu Beer-Lambertova zákona. Při více vzorcích je vhodné použít stejné typy kyvet a pečlivě dodržet postup pro minimalizaci zbytkových zbytků. Pro zlepšení kvality se doporučuje kalibrovat spektrofotometr pravidelně a srovnávat s referenčními standardy; měření je vhodné provádět s konstantní teplotou a v souladu s pokyny laboratoře.
Nyní si shrňme hlavní kroky při práci se spektrofotometrem Libra S6:
- Nejprve zapněte přístroj a nechte jej stabilizovat 45 minut, poté zvolte vlnovou délku podle experimentu.
- Umístěte slepý vzorek do držáku a nastavte nulu na displeji.
- Vložte kalibrační standard a zapište čtení; porovnejte s kalibračním certifikátem a případně proveďte opravu nebo znovakalibraci.
- Odeberte vzorek do čisté kyvety, zkontrolujte, že kyveta není znečištěná a že je plně naplněna na správnou úroveň.
- Pro měření v řadách vzorků v destičkách zajistěte identické podmínky, homogenitu roztoků a minimální bublinky.
- Po dokončení experimentu zaznamenejte data, čas, vzorek, vlnovou délku a absorbanci; použijte standardní tabulky a následně provádějte analýzu dle Beer-Lambertova zákona.
Pro kvantitativní získání koncentrací lze použít standardní křivku: připravte roztoky se známými koncentracemi, změříte jejich absorbance, a z vyneseného grafu absorbance versus koncentrace odhadnete neznámé koncentrace. Při interpretaci výsledků je důležité mít na paměti, že rozklížené spektrum mohou mít interferující složky; v takových případech lze využít derivativní spektrofotometrii pro přesnější identifikaci poloh absorpčních maxim. Lambda max bývá u různých látek různá; karbonylové skupiny často ukazují vrchol mezi 270 a 300 nm, aromatické kruhy pak kolem 250-280 nm. Je důležité vybírat vlnovou délku, která maximalizuje citlivost a minimalizuje interferenci. Lambda max se používá pro výpočet koncentrací a pro porovnání různých látek; data z velkých databází pomáhají zhodnotit spolehlivost lambda max napříč látkami.
Pro bezpečné a efektivní používání spektrofotometru je nutné dodržovat bezpečnostní pravidla, používat ochranné prostředky a udržovat čisté pracoviště. Před zahájením měření je třeba nastavit a kalibrovat spektrofotometr, a vždy vycházet z návodu výrobce. Při měření se sleduje absorpce a transmise; detektor poskytuje odhad absorpce a průchodnosti světla vzorkem. Při výuce UV-Vis spektroskopie studenti získávají praktické zkušenosti s identifikací vzorků, určením koncentrací a porozuměním spektrálním charakteristikám.
Jak funguje jednoduchý UV-VIS spektrofotometr
Praktické tipy pro použité roztoky a roztokové prostředí
V UV-Vis spektroskopii vždy zkontrolujte typ lampy a šířku štěrbiny, aby odpovídaly potřebám spektra. Vzorek umístíte do kyvety, která je v držáku vzorku. Kyveta musí být čistá, aby spektrum prošlo. Pro měření UV-Vis fungují nejlépe křemenné kyvety, protože propouštějí UV světlo. Při větší koncentrovanosti lze použít kratší dráhu kyvety. Při zpracování vzorků je nutné zachovat konzistenci a používat stejné typy kyvet pro srovnání dat.
V některých případech je nutné odečíst vlivy překážejících složek; pro tyto účely se používají slepé vzorky a korekční faktory. Záznamy o kalibraci a ověření je nutné uschovat pro budoucí použití. Při zpracování dat je důležité sledovat drift přístroje a případně provést opakovanou kalibraci, zejména při změnách teploty místnosti. Biochimické a biochemické analýzy často vyžadují měření změn spektrálních maxima během reakcí NAD+/NADH a podobně, či derivativní spektrum pro přesnější identifikaci poloh absorpčních maxim.
Shrnutí hlavních principů a použití
- Spektrofotometr Libra S6 umožňuje měřit absorbanci při vybraných vlnových délkách a zjistit koncentraci látky v roztoku.
- Beer-Lambertův zákon spojuje absorbanci s koncentrací a délkou dráhy kyvety, což umožňuje kvantitativní analýzu.
- Pro zajištění přesnosti je nutné správně připravit vzorky, použít čisté kyvety, minimalizovat odrazy a vyrovnat podmínky mezi slepým vzorkem a vzorky.
- Derivační spektrofotometrie a multikomponentní analýzy pomáhají řešit problémy s překrýváním spekter různých látek.
- Vzdělávací a laboratorní aspekty zahrnují správné nastavení, kalibraci, záznam dat a vyhodnocení výsledků s ohledem na chybovost a reprodukovatelnost.