Fluorescenční mikroskop je optický mikroskop využívající fluorescenci k zobrazení organických i anorganických struktur. Ve fluorescenční mikroskopii se využívá kratších vlnových délek v oblasti UV záření, kdy látka absorbuje ultrafialové paprsky a emituje viditelné světlo delších vlnových délek, které je pak pozorovatelné světelným mikroskopem. Dochází k ozáření atomu, kde za normálních okolností obíhají elektrony kolem jádra ve vrstvách (orbitalech) s určitou energetickou hladinou. Při UV záření elektrony absorbují energii a jsou vybuzeny (excitovány) do vyšší energetické hladiny. Elektrony jsou na vyšší energetické hladině nestabilní a vracejí se zpět do základního stavu. Zdrojem záření většinou bývá vysokotlaká rtuťová výbojka. Křemenná trubice v sobě ukrývá malé množství rtuti a inertního plynu. V intervalu 356-546 nm vydá největší množství energie. Výkon výbojek bývá různý, používají se výbojky s výkonem 50, 100 a 200 W. Excitační záření projde nejdříve excitačním filtrem. Tento filtr dovolí prostupu světla jen o výše zmíněné vlnové délce. Zabraňuje prostupu světla o vlnových délkách záření emitovaného (fluorescenčního), to by vyvolalo nežádoucí barevné pozadí. Záření se odráží a prochází přes objektiv na vyšetřovaný vzorek. Ve vzorku vyvolají excitaci elektronů a následné vyzáření světla. Emitované záření má větší vlnovou délku a šíří se všemi směry. Díky imerznímu objektivu a oleji prochází jen část z něj a dále dopadá rovněž na dichroické zrcadlo. Toto zrcadlo odstraňuje nežádoucí excitační záření o vysoké intenzitě (nebezpečné pro oko, zhodnocení pozorování) a propouští emitované záření. Emitované záření dále prochází bariérovým filtrem. Ten propouští jenom emitované záření v délce podle používaného fluorochromu, kratší vlnové délky zastaví.
Používá se taktéž v laboratořích, ale má jiné uspořádání. Zdroj záření je umístěn stejně jako u klasického mikroskopu pod preparátem. Zvláštně uspořádaný zástinný kondenzor pak propustí světlo tak, aby na vzorek dopadalo z boku. Nebezpečné excitační světlo pak letí mimo objektiv a objektivem prochází jen světlo emitované. Tento typ fluorescence se vyskytuje pouze v některých buňkách (především v rostlinných buňkách, pletivech) a intenzita fluorescence nebývá příliš silná.
Princip fluorescenční mikroskopie spočívá v nanesení fluorescenční látky (fluorochromu) na zkoumané struktury, která nám ji po ozáření umožní zobrazit. Mezi známé fluorochromy pro vizualizaci nukleových kyselin patří např. akridinová oranž, ethidium bromid nebo DAPI (4´, 6-diamidino-2-fenylindol dihydrochlorid). Dále FITC (fluorescein-5-isothiokyanát), TRIC, Texas Red. Mezi velmi používané markery řadíme i zelený fluorescenční protein GFP (green fluorescent protein), který byl izolován z mořské řasy Aequorea victoria a díky němu můžeme sledovat označené struktury v buňce.
Fluorescenční mikroskopie nám jak první umožnila vizualizovat struktury cytoskeletu eukaryontních buněk, využívá se v imunohistologii, imunocytologii a imunocytochemii. V buněčné biologii je hojně využíván k identifikaci složek cytoskeletu, buněčných organel nebo ke sledování biochemických dějů. V mikrobiologii se využívá fluorescenční mikroskop k identifikaci různých bakteriálních rodů. V cytogenetice se využívá metoda FISH (in situ hybridizace), kdy pomocí fluorescenčně značené DNA (RNA) sondy detekujeme určité vybrané úseky DNA či chromozomů a můžeme diagnostikovat např. Buňka.
Optická přesnost ve fluorescenční mikroskopii zahrnuje zohlednění více faktorů: optimalizace drah paprsků, výběr a integrace filtrů, použití vysoce kvalitních povlaků, které minimalizují odrazy a aberace. V této složité souhře optických prvků každý komponent přispívá ke zvýšení celkové přesnosti mikroskopického systému, což vede k lepšímu rozlišení a detailnímu měření v nanometrovém měřítku.
Obrázek 1: Princip fungování fluorescenčního mikroskopu. Vizualizace fluorescence ve fluorescenčním mikroskopu je zajištěna speciálními filtry, které umožňují průchod jednotlivých vlnových délek: excitační filtry, emišní filtry a dichroické zrcadlo. Dichroické zrcadlo odráží stimulační vlnovou délku k objektivu, který soustředí paprsek na preparát. Světlo odražené od vzorku se soustředí v objektivu a ve svém excitovaném stavu má obvykle delší vlnovou délku než dopadající světlo.
Obrázek 2: Měřicí vzorek osvětlený Gaussovým profilem (vlevo) ve srovnání s osvětlením pomocí profilu Top-Hat (vpravo). Top-Hat zajišťuje rovnoměrné osvětlení a tím jednotnou aktivaci molekul i bezproblémové spojování obrazů s minimálním překryvem. Tento kompaktní systém využívá asféry pro tvarování paprsku a transformuje Gaussův profil na Flat-Top, čímž zajišťuje homogenní osvětlení v celém zorném poli.
Obrázek 3: (a) Schéma tvarování paprsku. (b) Experimentální sestava. Konfigurace Flat-Field Illumination (FFI) přetváří Gaussovy paprsky na rovnoměrný Flat-Top profil. TopShape je tolerantní vůči variacím ve velikosti vstupních laserových paprsků a pracuje achromaticky; přináší vysoký optický výkon a homogenitu > 95 %. Touto technikou lze pozorovat přítomnost studovaných proteinů v buněčných organelách nebo určitou sekvenci nukleové kyseliny v buňkách.
V mikrobiologii slouží k mikroskopické identifikaci mikroorganismů; například lze mikroskopicky pozorovat patogenní bakterie ve směsi s ostatními bakteriemi. Při obarvení dvou různých proteinů fluorochromy různé barvy lze studovat jejich vzájemnou interakci. Princip fluorescenční mikroskopie je založen na zobrazení molekuly v minimálním množství díky záření (fluorescenci) molekuly po dopadu ultrafialového světla. Nejčastěji se využívá vazby fluorochromu na molekulu proteinu či specifickou sekvenci nukleových kyselin. Interference excitačního světla lze odstranit filtrem, který do okuláru propustí jen světlo excitované; to je charakteristické pro fluorochrom navázaný na pozorované molekule.
Pohyb virových proteinů v buňce je demonstrovaný pomocí animací systému „live imaging“ při studiu interakcí dvou značených proteinů. Druhé video ukazuje prohlížení vrstev buňky při zjišťování lokalizace virového proteinu. V kontextu medicíny může být fluorescenční mikroskopie použita pro vizualizaci různých buněčných procesů a testů odpovědi, například při studiu interakce proteinů či transportních systémů.
Fluorescenční mikroskopie umožňuje pozorování buněk v reálném čase a v imunochemických metodách umožňuje identifikaci buněčných struktur. Intenzita fluorescenčního signálu je výsledkem spolupůsobení faktorů jako je množství fluorochromu, jeho kvantová účinnost a podmínky prostředí. Nejčastější fluorochromy mají kvantovou účinnost kolem 30%, avšak mohou být ovlivněny photobleachingem a dalšími podmínkami.
Imaging Protein-Protein Interactions l Protocol Preview
tags: #fluorescencni #mikroskopie #test #odpovedi